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La leucemia linfatica cronica (CLL) è un disordine linfoproliferativo cronico di natura monoclonale caratterizzato dall’accumulo di linfociti CD5+/CD23+ nel sangue periferico, midollo osseo e negli organi linfoidi secondari. In vivo le cellule di CLL si accumulano in modo progressivamente inarrestabile; al contrario, quando coltivate in vitro vanno rapidamente incontro ad apoptosi. In vivo la cellula neoplastica interagisce con il microambiente, in particolare cellule stromali mesenchimali (BMSC), cellule nurse like (NLC), cellule T e cellule endoteliali (EC), che supportano la sopravvivenza delle cellule leucemiche e le proteggono dall’apoptosi spontanea o indotta dai farmaci. Recentemente sono stati introdotti, nel trattamento della CLL, nuovi farmaci inibitori di tirosin chinasi che sono in grado di interferire con il microambiente. Questi nuovi farmaci includono l’inibitore della PI3K delta GS-1101.
Abbiamo studiato il ruolo svolto dal contatto cellulare tra cellule leucemiche e cellule endoteliali o stromali nel mediare segnali di sopravvivenza andando a esaminare i cambiamenti nei profili di espressione genica causati dal tale interazione cellulare. Abbiamo poi approfondito il meccanismo d’azione di GS-1101 concentrando la nostra attenzione sull’effetto causato sulla sopravvivenza e adesione delle cellule di CLL in coltura con cellule endoteliali (EC) e stromali (BMSC).
Per studiare il ruolo del microambiente nel mediare segnali di sopravvivenza, abbiamo coltivato le cellule di CLL in presenza o assenza di EC (HUVEC e UV-2) e BMSC (KUSA H-1 e NKtert) per 72 ore. Abbiamo dimostrato che sia EC che BMSC proteggono le cellule di CLL dall’apoptosi: le cellule BMSC mostravano un effetto maggiore che può spiegare il perché il midollo è la sede preferenziale di recidiva nei pazienti affetti da questa forma di leucemia. Il contatto con le cellule endoteliali induceva un cambiamento nei profili di espressione genica della cellula leucemica come ad esempio geni coinvolti nelle vie del segnale integrinico, nell’adesione e nella migrazione. Per meglio approfondire il meccanismo di adesione delle cellule di CLL alle cellule del microambiente, abbiamo utilizzato degli anticorpi in grado di antagonizzare la via del segnale delle integrine beta1 e beta2. Bloccando l’interazione tra l’integrina VLA4 o LFA1 presente sulla superfice della cellula di CLL e VCAM-1 o ICAM-1 sulla superficie delle cellule endoteliali, il vantaggio di sopravvivenza garantito dal contatto cellulare diminuiva.
GS-1101 presenta una peculiare attività clinica caratterizzata da una risoluzione della linfadenopatia con ridistribuzione dei linfociti di CLL dai tessuti nel sangue. Abbiamo approfondito il meccanismo di azione di questo farmaco andando ad esplorare gli effetti sull’adesione e sulla sopravvivenza della cellula di CLL mediati dal contatto cellulare. A questo scopo abbiamo stimolato le cellule endoteliali e stromali con TNF alfa in modo da aumentare l’espressione dell’integrina VCAM-1 sulla superficie delle cellule endoteliali. Questo trattamento aumentava la capacità delle cellule di CLL di aderire alle cellule EC e BMSC e risultava inibita a seguito del trattamento con GS-1101. GS-1101 era anche in grado di interferire con la protezione dall’apoptosi indotta dal contatto cellulare.
Questi dati dimostrano che le cellule endoteliali e le stromali sono in grado di proteggere le cellule di CLL dall’apoptosi e modificano il loro profilo di espressione genica. In aggiunta questi risultati mettono in luce la peculiare attività del nuovo inibitore della PI3K delta, GS-1101, mostrando un doppio meccanismo d’azione di diminuzione dei segnali di sopravvivenza mediati dal microambiente e riducendo le interazioni che mantengono il clone leucemico a contatto con il microambiente.

Chronic Lymphocytic Leukemia (CLL) is a monoclonal disorder characterized by accumulation of CD5+/CD23+ lymphocytes in the peripheral blood, bone marrow and secondary lymphatic tissues. CLL B cells continually accumulate in vivo, but in vitro they undergo rapidly in apoptosis. This suggests that interactions between CLL cells and accessory cells in tissue microenvironments, such as mesenchymal stromal cells (MSC), nurse like cells (NLC), T cells and endothelial cells (EC) are critical for maintaing CLL cell survival and protecting from spontaneous and drug-induced apoptosis. Recently novel kinase inhibitors interfering with the proactive role of the microenvironment are under development in CLL and demonstrate encouraging clinical activity. These new agents include the PI3Kδ inhibitor GS-1101. GS-1101 induces apoptosis in CLL cells in vitro and inhibits the supportive effect of many microenvironmental factors such as co-culture with NLCs, activation of BCR, of CD40L, BAFF, TNFα, or fibronectin, leading to suppression of AKT activation. Here, we investigated the ability of endothelial and bone marrow stromal cells contact to rescue CLL cells from apoptosis. We analyzed gene expression changes in CLL cells modulated by endothelial cell interaction with particular interest in the integrin signalling and cell adhesion. Moreover we examined GS-1101 effects on CLL cell survival and adhesion to endothelial and bone marrow stromal cells. To investigate the role of EC and BMSC in supporting CLL viability, we co-cultured CLL cells for 72h in presence or absence of EC (HUVEC and UV-2) or BMSC (KUSA-H1 and NKtert). We found that both, EC and BMSC rescue CLL cells from spontaneous apoptosis: BMSC were more effective which may explain why the marrow is a preferred site for residual disease and relapse in patients with CLL. Physical contact with endothelial cells modulated different genes in CLL cells such as genes involved in integrin signalling, adhesion and migration. To investigate the mechanism of CLL cell adhesion to microenvironmental accessory cells, we used neutralizing antibodies to antagonize β1- and β2- integrin pathways demostrating that blocking interaction between VLA4 or LFA1 on CLL and VCAM-1 or ICAM-1 on EC significantly decreased the survival advantage in the co-culture system. Given the peculiar clinical activity of GS-1101 to cause rapid resolution of lymphadenopathy with redestribution of CLL from tissues into the blood, we characterized the nature of GS-1101 exploring the effects on CLL cell adhesion and survival mediated by intimate contact with EC and BMSC. We performed adhesion assays activating both EC and BMSC with TNFα to upregulate VCAM-1 expression observing that treatment with TNFα significantly increased the ability of CLL cells to adhere to EC and BMSC and was reduced in presence of 5μM GS-1101. To test the effects of GS-1101 on EC- and BMSC-mediated CLL cell protection, CLL cells were cultured on EC or BMSC in presence or absence of 5μM GS-1101 and CLL cell viabilities were assessed at different time-points. GS-1101 significantly overcame CLL cell protection for EC and BMSC indicating that GS-1101 inhibited BMSC- and EC-derived pro-survival signals. These data demonstrate that marrow stromal and endothelial cells both support the viability and protect CLL cells from apoptosis. In particular adhesion to endothelium strongly supports survival, protects from drug-induced apoptosis and modifies the gene expression profile of leukemic cells. In addition our findings highlight the peculiar activity of a new PI3Kδ inhibitor, GS-1101, with a dual mechanism of decreasing microenvironmental pro-survival signals and reducing interactions that retain CLL cells in the tissue microenvironment.