• inibitori chinasi
• LLA-T
• metabolismo
• PI3K/Akt/mTOR
• RPPA

La Leucemia Linfoblastica Acuta a cellule T (LLA-T) è una malattia aggressiva ed eterogenea, nella quale l’accumulo di alterazioni a livello molecolare risulta nella trasformazione di precursori di linfociti T. Ad ora la prima scelta terapeutica rimane l’utilizzo di alte dosi di chemioterapici, a sottolineare quindi la necessità di identificare nuovi bersagli molecolari e relativi inibitori, supportati da studi biologici che ne testino l’efficacia.
Nei pazienti di LLA-T spesso ritroviamo mutazioni/delezioni a carico di NOTCH1 e PTEN, assieme a overespressione di c-Myc e iperattivazione del signaling di PI3K. Tuttavia, data soprattutto la sua eterogeneità, questa patologia rimane poco caratterizzata dal punto di vista bioenergetico.
Sulla base di queste premesse, è stata svolta una valutazione comprensiva del metabolismo, del profilo mutazionale e del fosforiloma di cellule primarie di pazienti LLA-T pediatrici e di linee cellulari recanti la forma wt o mutata di NOTCH1/PTEN.
Dal sequenziamento degli esoni 26, 27, 28 e 34 per NOTCH1, e dell’esone 7 per PTEN, sono stati identificati 56 pazienti con NOTCH1 wt (40%) e 16 pazienti con PTEN mutato. Finora 22 dei pazienti NOTCH1 wt sono stati analizzanti mediante reverse phase protein arrays (RPPA) per determinare i livelli della via di PI3K/mTOR. Sono stati osservati alti livelli di fosforilazione di AKT e dei suoi substrati (come Ser21/9 di GSK3αβ [r=0.65] o 4EBP1 [r=0.79]) nei pazienti con PTEN mutato, mostrando che dove PTEN è downregolato la via di segnale è iperattiva.
Inoltre, in un pannello di 13 linee cellulari in grado di rappresentare i tratti distintivi della LLA-T, si è visto che cellule mutate sia su NOTCH1 che su PTEN mostrano un fenotipo più glicolitico, rispetto a quelle wt o con singola mutazione, e una più alta attività OXPHOS, a indicare che qui il tasso di glicolisi non dipende da disfunzioni mitocondriali. In queste cellule l’inibizione della glicolisi, attraverso il 2-DG, e del signaling di PI3K/mTOR, grazie al PF-4691502, rendono le cellule metabolicamente inattive, come rivelato dall’analisi dell’acidificazione extracellulare e del consumo di ossigeno con il Seahorse XF96 Analyzer, e mostrano un effetto citotossico sinergico. In cellule con NOTCH1 wt e PTEN wt la combinazione di 2-DG e PF-4691502 causa minori livelli di apoptosi. Grazie ad approfondimenti, è stato notato che queste cellule recano alti livelli di PTEN fosforilato su S380, sito inibitorio di fosforilazione da parte di CK2, con conseguente attivazione di PI3K/mTOR. È stato dimostrato poi che trattando le cellule con un inibitore specifico di CK2, CX-4945, da solo o con 2-DG, è possibile ottenere un’elevata citotossicità. Dati preliminari ottenuti da blasti primari di pazienti di LLA-T (4 adulti e 2 pediatrici) hanno confermato questi risultati, sottolineando ancora una volta la forte eterogeneità presente in queste cellule. Con RPPA sono stati visti alti livelli di PTEN S380 in cellule primarie di pazienti con PTEN wt (r=0.95), denotando che anche qui PTEN è inattivo. Questo risultato è particolarmente degno di nota poiché l’inibizione dell’attività di PTEN porta in ultima istanza all’attivazione costitutiva della via di segnale come se vi fosse la relativa mutazione /delezione, e dovrebbe perciò sempre essere tenuta in considerazione.
In conclusione, questo studio ha evidenziato la possibilità di stratificare queste leucemie in relazione al fenotipo metabolico, al profilo mutazione e di signaling, che correlano con la risposta a specifici inibitori. L’analisi del fosforiloma si integra alle informazioni ottenute dal sequenziamento fornendoci ulteriori dati che possono essere sfruttati per identificare nuovi bersagli terapeutici, come l’esempio della fosforilazione di PTEN nel caso di cellule PTEN wt.

T-cell Acute Lymphoblastic Leukemia (T-ALL) is an aggressive, heterogeneous malignancy where accumulation of molecular alterations in a multistep pathogenic process results in the transformation of T-cell progenitors. As nonspecific, high-dose multiagent chemotherapy is still the first therapeutic choice, there is an unquestioned need to identify novel molecular targets and their selective inhibitors, along with biological studies supporting the efficacy of the drugs. T-ALL patients often display NOTCH1 and PTEN mutation/deletion, together with c-Myc overexpression and ectopic PI3K signaling overactivation. However, possibly because of its heterogeneity, T-ALL remains poorly characterized from a bioenergetical point of view. Based on these premises, a comprehensive evaluation of energy metabolism, mutational features and PI3K pathway phosphoproteomics of primary pediatric T-ALL cells and cell lines carrying either wt or deleted NOTCH1/PTEN was performed. By sequencing of exons 26, 27, 28 and 34 for NOTCH1, and of exon 7 for PTEN, 56 patients with wt NOTCH1 (40%) and 16 patients mutated for PTEN were found. Hitherto 22 of the wt NOTCH1 patients have been profiled by reverse phase protein arrays (RPPA) to determine the levels of key endpoints of the PI3K/mTOR pathway. We observed higher phosphorylation levels of AKT and AKT effectors (such as the biomarkers Ser21/9 GSK3αβ [r=0.65] or 4EBP1 [r=0.79]) in PTEN-mutated patients, indicating that the pathway is hyperactivated in PTEN-downregulated T-ALL. Moreover, in a panel of 13 well characterized cell lines recapitulating the hallmarks of T-ALL, we found that cells carrying both NOTCH1 and PTEN mutations displayed a more glycolytic phenotype, compared to those with wt and/or a single mutation, and a higher OXPHOS activity, indicating that here the higher glycolytic rate does not depend on mitochondrial dysfunction. Besides, in these cells combined blockade of glycolysis by 2-Deoxy-D-Glucose and PI3K/mTOR signaling by PF-4691502 rendered cells metabolically inactive, as monitored by extracellular acidification and oxygen consumption rates with the Seahorse XF96 Analyzer, and displayed high synergistic cytotoxicity. Surprisingly, in cells carrying both wt NOTCH1 and PTEN the association of 2-DG and PF-4691502 triggered apoptosis to a lesser degree. By further investigation we found that these cells have high levels of phosphoS380-PTEN, an inhibitory site phosphorylated by CK2, leading to constitutive PI3K/mTOR activation. Eventually, we demonstrated that cell treatment with the specific CK2 inhibitor CX-4945, alone or combined to 2-DG, overcome aberrant PI3K/mTOR signaling leading to extensive cytotoxicity. Preliminary data obtained from primary blasts from T-ALL patients (4 adult and 2 pediatric samples) confirmed our results, highlighting nonetheless the wide heterogeneity present in these cells. Remarkably, by RPPA we found very high S380-PTEN levels in primary cells from wt PTEN patients (r=0.95), indicating that also in these cells PTEN is inactive. We regard this result as particularly noteworthy as inhibition of PTEN activity, although often overlooked, ultimately leads to constitutive activation of the pathway similarly to the much more broadly investigated PTEN mutation/deletion, and should therefore be routinely taken into consideration. In conclusion, this study pointed out the possibility to stratify T-ALLs according to metabolic phenotype, signaling profile and mutational status, which are correlated with their response to specific inhibitors. The phosphorylome analysis integrate the NGS information by giving us additional data that can be exploited to identify novel potential therapeutic targets, such as the role of PTEN phosphorylation in the context of wt PTEN cells.