• HIV
• inflammasomi
• monociti
• rapporto CD4/CD8
• reservoir virale

Da anni, la terapia antiretrovirale ha permesso il trattamento dell’infezione da HIV, il virus responsabile dell’AIDS, riducendo la morbilità e la mortalità dei pazienti. Tuttavia, a oggi, non esistono strategie terapeutiche per eradicare il virus, che ha la capacità di integrarsi nel DNA di diversi tipi di cellule dell’ospite. È pertanto fondamentale capire quali siano i fattori che incidono sul reservoir virale intracellulare, in particolare nei pazienti con viremia plasmatica al di sotto dei limiti di misurazione ma in cui il DNA virale è rilevabile all’interno delle cellule T CD4+, che rappresentano il reservoir principale. Dato che le diverse sottopopolazioni di cellule T CD4+ differiscono tra loro in termini d’infezione latente da HIV e di differenziamento, abbiamo studiato alcuni dei meccanismi di mantenimento del reservoir in cellule T CD4+ naïve (TN), di memoria centrali (TCM) e di memoria effettrici (TEM), analizzando la proliferazione omeostatica (attraverso la quantificazione di sjTREC e la lunghezza dei telomeri) oltre ai livelli di HIV DNA intracellulari. Per questo, abbiamo ideato un approccio innovativo combinando cell sorting e droplet digital PCR (ddPCR). Sono stati arruolati 32 pazienti HIV+, in terapia, con viremia non misurabile da almeno 2 anni e conta di CD4+ >500 cellule/ µL. Abbiamo isolato le cellule TN, TCM and TEM e abbiamo quantificato il DNA provirale e il sjTREC in ogni subset con la ddPCR. I livelli di HIV DNA sono inferiori nelle TN, rispetto alle altre. Nelle TN e TCM, il DNA provirale è maggiore in pazienti in terapia da minor tempo, o con rapporto CD4/CD8 inferiore, confermando l’importanza dell’inizio precoce della terapia e della normalizzazione del rapporto CD4/CD8. I livelli di sjTREC, come atteso, sono maggiori nelle TN, rispetto alle altre popolazioni. L’utilizzo di un approccio basato su cell sorting e ddPCR ha permesso la caratterizzazione del reservoir, ponendo l’accento sull’importanza delle TCM, il subset di maggiori dimensioni e durata di vita.
Il rapporto CD4/CD8 è legato anche ad altri aspetti nell’infezione da HIV, quali l’immunosenescenza e le co-morbilità ad essa correlate. In molti pazienti, un basso rapporto CD4/CD8 persiste nonostante la terapia. I motivi della mancanza di normalizzazione sono in parte sconosciuti e molti studi si focalizzano sulle modificazioni dell’immunità adattativa. Il ruolo dei monociti e la loro capacità di innescare il processo infiammatorio attraverso l’attivazione degli inflammasomi è stato poco o per nulla analizzato in questo contesto. Per questo, abbiamo selezionato pazienti HIV+ con rapporto CD4/CD8 normale (15 pazienti, NR) o basso (11 pazienti, LR) e 10 soggetti sani di cui è stato analizzato il fenotipo monocitario mediante citofluorimetria. I monociti classici e intermedi dei pazienti NR esprimono livelli maggiori di CCR2 in superficie, mentre l’espressione di CCR5 è maggiore nei monociti classici di pazienti LR, condizione che potrebbe essere correlata allo sviluppo di deficit neurocognitivi. Inoltre, sui monociti stimolati con LPS o ATP è stata analizzata l’espressione genica dei principali componenti degli inflammasomi: i pazienti NR presentano livelli minori di mRNA di NAIP e PYCARD, indicando, da un lato, una minore capacità di attivazione e, dall’altra, una diversa abilità nella presentazione dell’antigene. Questo potrebbe indicare che i monociti possano contribuire a contenere l’attivazione immunitaria e l’espansione di cellule immunosenescenti nei soggetti NR.

The infection by the Human Immunodeficiency Virus (HIV), responsible for AIDS, is successfully treated by antiretroviral therapy, which had strongly reduced morbidity and mortality. However, the eradication of the virus remains an unsolved problem, since several cell populations contain its hidden reservoir. Therefore, understanding the factors that influence intracellular viral reservoir is crucial, particularly in patients with undetectable viremia. Viral DNA is indeed detectable even in these patients, and in particular within CD4+ T cells, that represent the main reservoir. Since within CD4+ T cells several subsets exist that differ in terms of HIV latent infection, we studied some of the mechanisms of reservoir maintenance in CD4+ T naïve (TN), central memory (TCM) and effector memory (TEM) cells, and we analyzed in these cells homeostatic proliferation by measuring sjTREC and telomere length, along with intracellular HIV DNA content. Notably, we set up an innovative and combined approach with cell sorting and droplet digital PCR. We enrolled 32 successfully treated HIV+ patients with undetectable viremia since at least 2 years and >500 CD4+ T cells/µL. TN, TCM and TEM cells were sorted, and proviral DNA and sjTREC were quantified in each subset by using droplet digital PCR. HIV-DNA levels were lower in TN, compared to both TCM and TEM populations. In TN and TCM cells, HIV proviral DNA was higher in patients with shorter time of treatment, or with lower CD4/CD8 ratio, independently of each other. On the other side, sjTREC levels were higher in TN population, respect to the other subsets. This study indicates that using an approach based upon cell sorting and droplet digital PCR allows a better comprehension of the reservoir features. Furthermore, it highlights the crucial role of TCM subset in HIV reservoir, considering its larger size and longer lifespan of these cells. Finally, it confirms the importance either of starting antiretroviral therapy as soon as possible or to obtain the normalization of the CD4/CD8 ratio. Even after many years of successful therapy, several patients do not normalize CD4/CD8 ratio, and thus this parameter, which is altered in immunosenescence, has gained a new important role as a marker of immune dysfunction during HIV infection. The persistence of a low ratio is related to chronic inflammation, which increases the risk of several diseases. Gaps in knowledge on the reasons of the lack of CD4/CD8 ratio normalization still exists, and most studies focused on adaptive immunity. We evaluated the role of monocytes, crucial members of innate immune system. They trigger inflammation through inflammasomes, able to activate the production of pro-inflammatory cytokines. In the second study, we investigated the role of inflammasomes in immune reconstitution by studying HIV+ patients with normal or low CD4/CD8 ratio. We enrolled 11 HIV+ patients with a ratio (LR), 15 with a normal ratio (NR), and 11 healthy subjects. After isolation of monocytes, we analyzed their phenotype by flow cytometry. CCR2 expression was higher in classical and intermediate monocytes from NR patients, while CCR5 expression increased in classical monocytes from LR patients. After stimulation with LPS or ATP, we analyzed gene expression of the main inflammasome components, and found that NR patients displayed lower levels of NAIP and PYCARD mRNA. On the one hand, higher levels of CCR5 expression observed in monocytes from LR patients could be responsible for the development of neurocognitive disorders. On the other hand, the lower mRNA expression of NAIP and PYCARD in monocytes from NR patients could indicate a lower capability to activate these cell populations, and a differential ability in antigen presentation.