Riassunto analitico
La tubercolosi (TB) è una patologia infettiva causata dal M. tuberculosis (Mtb) che colpisce principalmente i polmoni, sopravvivendo all’interno dei macrofagi alveolari (AM). Secondo il report 2016 dell'OMS, la TB rimane una delle malattie trasmissibili più diffuse. L'attuale terapia prevede un lungo periodo di trattamento (6/7 mesi + 1/2 anni di consolidamento), dosi elevate e frequenti che determinano diversi effetti collaterali quali l’epatotossicità. Per evitare questi inconvenienti, la via polmonare sembra essere la strategia più indicata per raggiungere prontamente il sito primario d’infezione. Questo approccio potrebbe ridurre dose, frequenza e periodo di trattamento, diffusione della patologia in altri organi, rischio di resistenza ai farmaci e, infine, miglioramento della compliance del paziente. Tra i dispositivi inalatori, l'inalatore a polvere secca (Dry Powder Inhaler, DPI) sembra essere il più vantaggioso considerando la bassa idrosolubilità della maggior parte dei farmaci anti-TB e la stabilità del prodotto finale. Poiché, in generale, i farmaci anti-TB non presentano idonee proprietà aerodinamiche e capacità di essere internalizzati dai macrofagi, nel presente progetto è stata sviluppata una polvere respirabile costituita da nanoparticelle solide lipidiche in clusters (SLNas) caricate con rifampicina (RIF) prodotta con materiali biocompatibili mediante tecnica di emulsione a caldo e liofilizzazione. I parametri di pre-congelamento sono stati modificati mediante “Design of Experiments” al fine di ottimizzare i requisiti di respirabilità della polvere. I risultati ottenuti hanno indicato quali parametri ottimali per ottenere una frazione respirabile >50%, il rapido raffreddamento a basse temperature, la diluizione in acqua del campione e l’assenza di crioprotettori. Le SLNas ottenute sono risultate efficaci per il targeting passivo ai macrofagi determinato su linee cellulari J774. Al fine di massimizzare il processo di fagocitosi attraverso un targeting attivo, la superficie delle SLNas è stata funzionalizzata mediante metil α-D-mannopiranoside (MP) in grado di riconoscere i recettori del mannosio localizzati sulla membrana dei macrofagi. Le SLNas mannosilate hanno mostrato proprietà fisiche adatte per il targeting passivo, livelli adeguati di caricamento in farmaco (10-15%) e capacità di immobilizzazione del farmaco prima dell'internalizzazione macrofagica. Per quanto riguarda il targeting attivo, la presenza di MP sulla superficie delle SLNas ha determinato un aumento della velocità di internalizzazione cellulare. Tuttavia, la mannosilazione ha compromesso le caratteristiche di respirabilità a causa di una maggior coesività della polvere attribuibile alle elevate forze di adesione tra i gruppi idrossilici del mannosio. Pertanto, sono state sviluppate nuove molecole anfifiliche (brevetto in fase di deposito) allo scopo di modificare la distribuzione del funzionalizzante sulla superficie delle SLNas e, di conseguenza, la respirabilità della polvere. I nuovi vettori funzionalizzati hanno dimostrato un'efficacia adeguata in termini di caricamento del farmaco, rilascio in vitro in fluido polmonare simulato, citotossicità, internalizzazione cellulare e trasporto intramacrofagico del farmaco. Inoltre, la respirabilità della polvere non è risultata compromessa dal processo di funzionalizzazione (frazione respirabile >50%). Le SLNas proposte in questo progetto di ricerca, prodotte con una tecnologia eco-friendly, in assenza di solventi organici e di reazioni chimiche per la funzionalizzazione superficiale, rappresentano un'opportunità per un’efficace terapia inalatoria anti-TB mediante dispositivi DPI.
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Abstract
Tuberculosis (TB) is an infectious disease caused by M. tuberculosis (Mtb), which may attack mainly the lungs surviving within alveolar macrophages (AM). According to the WHO global report 2016, TB remains one of the world’s deadliest communicable diseases.
The current therapy following WHO guidelines involves drug oral regimen (first-line drugs), long-term therapy (6/7 months + 1/2 years of consolidation), high and frequent doses so producing several side-effects, in particular hepatotoxicity. To overcome these drawbacks and improve treatment efficacy, pulmonary route appears the most promising strategy to reach promptly the primary infected site. In this way, several advantages such as reduced dose, dose frequency, treatment period, TB dissemination in other organs, risk of drug-resistant mutants, and toxicity as well as improving patient’s compliance, can be achieved. Among the inhalation devices, Dry Powder Inhaler (DPI) appears more advantageous considering low water solubility of most anti-TB drugs, propellant absence, and drug stability in its dry state. Because anti-TB drugs fail in respirability properties and macrophage internalization, their embedding in particulate delivery systems represents a suitable action plan.
In order to fulfill this goal, respirable powder of rifampicin (RIF) loaded Solid Lipid Nanoparticle assemblies (SLNas) able to be transported into AM were developed using biocompatible materials handled by melt emulsifying technique and freeze-drying. Pre-freezing parameters were modified conveniently by means of Design of Experiments approach in order to optimized respirability requirements. The most favorable impact on powder respirability was exerted by quick freezing at low temperature (-70°C), sample water dilution, and absence of cryoprotectants. The designed SLNas were found to be respirable (>50% respirable fraction) and effective for macrophage passive targeting on J774 cell line.
With the aim to maximize the phagocytosis process through active targeting, SLNas surface was functionalized by methyl α-D-mannopyranoside (MP) able to recognize mannose receptors located on AM membrane.
Mannosylated SLNas exhibited adequate rifampicin payloads (10-15%) and feasible drug maintenance within the lipid matrix along the respiratory tract before AM internalization. Concerning active targeting, the presence of MP on SLNas surface caused a rapid cell internalization. Nevertheless, mannosylation determined a reduction in respirability probably owing to moisture adsorption on mannose residues and high adhesion forces among mannose hydroxyl groups leading to powder cohesiveness. Therefore, novel more balanced amphiphilic molecules (under patent application) bearing mannose residues differently arranged on SLNas surface were considered as active targeting moieties to reach improved respirability performance. The obtained functionalized carriers exhibited adequate efficiency in terms of drug loading, in vitro drug release in simulated lung fluid, cytotoxicity, cell uptake, and RIF translocation inside macrophages. Moreover, the surface mannosylation by means of the novel molecules did not impaired powder respirability (>50%). This novel functionalization technique avoiding chemical reactions thereby exhibits manageability for scale-up production.
SLNas proposed in this research project produced by a green-technology avoiding organic solvents may represent an encouraging opportunity in a perspective of an efficacious anti-TB inhaled therapy by means of DPI devices.
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