Riassunto analitico
Fino al 35% dei pazienti affetti da epilessia è resistente ai farmaci antiepilettici (AEDs) in uso. Di recente, la ricerca di nuovi AEDs si è orientata allo studio di peptidi ed enzimi attivi sul cervello, come la ghrelina ed i suoi analoghi, o le metalloproteinasi (MMPs). In particolare, la ghrelina ed il suo recettore (GHS-R1a) sono stati studiati per le loro proprietà antiepilettiche. È noto che EP-80317, antagonista di GHS-R1a, abbia proprietà anticonvulsivanti in modelli animali di stato di male epilettico (SE). Tuttavia, è dubbio che tale effetto possa essere determinato dalla interazione con GHS-R1a. Analogamente, il ruolo delle MMPs è stato studiato in patologie con spiccati fenomeni infiammatori. In particolare, MMP-12 può degradare diversi componenti della matrice extracellulare ed è espressa dalla microglia e dai leucociti infiltranti. Resta, quindi, da chiarire se MMP-12 partecipi alla rottura della barriera emato-encefalica ed alla successiva morte neuronale che segue lo SE.
L’obiettivo è quello di: 1) caratterizzare il coinvolgimento nell’attività anticonvulsivante di EP-80317 di vie trasduzionali alternative; 2) chiarire se l'inibizione di MMP-12 dopo SE possa rappresentare una terapia contro la morte neuronale che si verifica durante la fase acuta di SE e nel corso dell'epilettogenesi.
Ho valutato gli effetti della modulazione farmacologica di EP-80317 e gli effetti di inibizione di MMP12 nel modello della pilocarpina e/o nel modello in cui le crisi epilettiche sono indotte da ripetute stimolazioni elettriche corneali alla frequenza di 6 Hz. In questi modelli, ho condotto analisi comportamentali, immunoistochimiche e elettrocorticografiche.
In entrambi i modelli, EP-80317 è stato in grado di limitare le crisi epilettiche, un effetto inibito dalla somministrazione dell’antagonista GW9662 del recettore attivato dai proliferatori dei perossisomi di tipo γ (PPARγ). Nell’ippocampo, la risposta ad EP-80317 si è accompagnata ad un limitato incremento delle isoforme 1 e 2 della chinasi attivata da segnali extracellulari (p-ERK1/2), incremento conseguente alle crisi epilettiche; in più, è stato rilevato un aumento di PPARγ non associato all’attività epilettica nel gruppo trattato con EP-80317. Tali effetti sono stati descritti dopo l’iniziale somministrazione di EP-80317, mentre le successive somministrazioni sono state caratterizzate da una progressiva diminuzione delle proprietà anticonvulsivanti di EP-80317, fenomeno legato all’aumento di p-ERK1/2 ed al ritorno ai livelli basali di PPARγ nell’ippocampo. Inoltre, nel modello della pilocarpina, iniezioni intra-ippocampali dell’inibitore di MMP12 hanno protetto i neuroni del CA3 e dell’ilo del giro dentato dalla morte cellulare, limitando l’area della lesione di tipo ischemico che si sviluppa nello strato lacunoso-molecolare dell’ippocampo. Infine, l’inibizione di MMP-12 ha contenuto l’essudazione di IgG ed albumina nel parenchima cerebrale.
Questi risultati suggeriscono che: 1) EP-80317 abbia proprietà anticonvulsivanti in relazione all’attività di p-ERK1/2 e, soprattutto, PPARγ, proteine che potrebbero essere utilizzate come marcatori di risposta all’anticonvulsivante. Inoltre, gli effetti anticonvulsivanti osservati tendono a diventare inefficaci con il perdurarsi delle crisi epilettiche, in concomitanza ad una ridotta modulazione dei marcatori considerati; 2) l’inibizione di MMP-12 possa contrastare la morte neuronale e l’inibitore utilizzato possa essere un potenziale agente terapeutico in patologie neurologiche caratterizzate da infiammazione e perdita neuronale. Tutto ciò suggerisce che PPARγ, p-ERK1/2 e MMP-12 possano essere promettenti targets per nuove strategie terapeutiche finalizzate alla cura delle crisi epilettiche e per il danno cerebrale associato.
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Abstract
Up to 35% of patients with epilepsy present intractable seizures because of resistance to antiepileptic drugs (AEDs). Recently, the search for new AEDs focused on the role of peptides and enzymes within the brain, such as ghrelin and cognate peptides or metalloproteinases (MMPs). Particularly, the role of ghrelin and its receptor (GHS-R1a) has been investigated in models of epileptic activity. Indeed, the GHS-R1a antagonist EP-80317 has anticonvulsant effects in animal models of status epilepticus (SE), but it is not clear if its effects depend on a mechanism involving GHS-R1a modulation. Similarly, the role of MMPs has been considered in conditions involving inflammation. Specially, MMP-12 is able to degrade a wide variety of extracellular matrix components and it is highly expressed in microglia and myeloid infiltrates. However, it has to be defined if MMP-12 is involved in blood-brain barrier (BBB) leakage and subsequent neuronal cell death following SE.
In my thesis, I aimed to: 1) elucidate the downstream molecular mechanisms through which EP-80317 exerts its anticonvulsant effects; 2) test if MMP-12 inhibition may represent a putative drug against neuronal cell death occurring after SE.
I assessed the therapeutic properties of EP-80317 and a hydroxypyrone-based inhibitor specific for MMP-12, using the pilocarpine model of SE and the repeated 6-Hz corneal stimulation model. In these models, I performed behavioral, immunohistochemical and/or video electrocorticographic (ECoG) analyses.
EP-80317 was able to antagonize seizures in both the pilocarpine and the repeated 6-Hz corneal stimulation models. Pre-treatment with the peroxisome proliferator-activated receptor gamma (PPARγ) antagonist GW9662 prevented most of EP-80317 anticonvulsant effects. Additionally, GW9662 decreased the latency to develop stage 4-5 seizures and accelerated the development of SE in the pilocarpine model. In the hippocampus of mice exposed to repeated sessions of 6-Hz corneal stimulation, the anticonvulsant effect of EP-80317 was associated with the prevention of the increase in levels of phosphorylated extracellular signal-regulated kinase 1/2 (p-ERK1/2, a marker of neuronal activation) as observed in control mice and, additionally, with increased levels of PPARγ. In particular, the observed effects on p-ERK1/2 and PPARγ immunoreactivity were directly related to the pharmacological activity of EP-80317. However, these effects vanished by repeating the sessions of seizure induction up to four. The transient nature of EP-80317 effect on overall seizures suggested the appearance of refractoriness to the tested anticonvulsant. Moreover, in the pilocarpine model, intra-hippocampal injections of the MMP-12 inhibitor protected CA3 and hilus of dentate gyrus neurons from cell death and limited the extent of the ischemic-like lesion that typically develops in the stratum lacunosum-moleculare of the hippocampus. MMP-12 inhibition also reduced IgG and serum albumin extravasation into brain parenchyma.
Overall, these results suggest that: 1) EP-80317 has anticonvulsant effects which involves modulation of p-ERK1/2 and PPARγ expression. The anticonvulsant effects of EP-80317 seem to decrease in presence of recurring seizures, a phenomenon associated with normalization of PPARγ expression and increase in p-ERK1/2 expression; 2) MMP-12 inhibition can directly counteract neuronal cell death and the MMP-12 inhibitor used in this study could be a potential therapeutic agent for neurological diseases/disorders characterized by an important inflammatory response and/or neuronal cell loss. Thus, it is suggested that PPARγ, p-ERK1/2 and MMP-12 are promising targets for novel therapeutic approaches to seizures and the related brain damage.
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