Riassunto analitico
Il recettore serotoninergico di tipo 3 (5-HT3) è un pentamero transmembrana selettivo per i cationi, le cui stechiometrie funzionali e la disposizione delle subunità sono ancora oggetto di discussione. Sono state identificate cinque differenti subunità, da A ad E. Solo la subunità A è in grado di formare recettori omopentamerici funzionali; le altre subunità sono apparentemente funzionali solo se co-espresse con A. La struttura 3D non è stata ancora risolta per nessuna delle subunità. Inoltre, la maggior parte dei dati disponibili su struttura e funzione del recettore riguardano il dominio extracellulare (ECD), mentre i domini transmembrana (TMD) e intracellulare (ICD) sono molto meno caratterizzati, anche se noti per avere un ruolo cruciale per la funzionalità del recettore. Il 5-HT3R è un bersaglio importante per molti farmaci neuroattivi, tra i quali il palonosetron rappresenta un potente antagonista di nuova generazione, il cui meccanismo d'azione non è stato ancora pienamente compreso. Recenti studi computazionali suggeriscono un possibile secondo sito d’azione nell’ECD, stimolando quindi un ulteriore interesse per lo studio della multivalenza nei 5-HT3Rs. Questa tesi ha l’obiettivo di comprendere le caratteristiche strutturali e funzionali del recettore 5-HT3 per approfondire la conoscienza di aspetti chiave ancora ampiamente discussi in letteratura, come ad esempio l'interfaccia di legame, la multivalenza del recettore e la sua composizione stechiometrica funzionale. A questo scopo, è stato realizzato un approccio combinato computazionale-sperimentale. Studi di docking su nuovi antagonisti sono stati effettuati utilizzando l’interfaccia di legame omomerica 5 HT3RAA precedentemente modellata, allo scopo di verificare la possibilità per il recettore di ospitare ligandi bivalenti arilpiperazina-derivati. L'analisi dei modi di legame ha identificato siti di legame supplementari che, assieme all’identificazione del possibile sito allosterico trovato per il palonosetron, potrebbe essere un punto chiave per la comprensione del funzionamento del 5-HT3R, in quanto suggerisce che la multivalenza potrebbe coinvolgere domini differenti dal sito di legame ortosterico. Al fine di verificare la presenza del possibile sito di legame allosterico trovato per il palonosetron, sono stati effettuati esperimenti di mutagenesi. Questi studi sono stati condotti nei laboratori di biochimica della Dr. Sarah Lummis presso la University of Cambridge (U.K.). Sono state prodotte una serie di mutazioni sperimentali: Tyr68, Phe125, Ser158 e Asp160 nella subunità A e His66, Phe123, Glu158, Tyr136 e Ile176 nella subunità B. I recettori omomerici ed eteromerici sono stati poi espressi in cellule HEK293 per determinare la potenza del palonosetron, sia attraverso studi funzionali, che di legame con radioligandi. I dati mostrano che solo Tyr68 potrebbe contribuire ad un sito di legame alternativo per il palonosetron. Gli altri residui potrebbero modificare la sensibilità del recettore. Infine, è stata eseguita un'analisi fisico-chimica sia dell’ECD che dei TMD/ICD allo scopo di identificare fattori che possano influenzare la stechiometria del recettore. I potenziali elettrostatico ed idrofobico delle diverse interfacce del 5-HT3R, calcolati su modelli 3D precedentemente costruiti, confermano la presenza di un cluster aromatico situato al centro dell'interfaccia AA quale fattore determinante per garantire sia la stabilità che la funzionalità dell'interfaccia. Inoltre, per la prima volta, sono stati costruiti per omologia modelli 3D dei domini TM/IC di tutte le subunità del recettore umano 5-HT3 ed assemblati in omo- ed eteropentameri. Dalle analisi delle sequenze, dei modelli e delle proprietà elettrostatiche, emerge che il passaggio dello ione Ca2+ attraverso il poro, all’altezza dei TMD e ICD, è favorito quando non più di due subunità B sono co-espresse nel pentamero.
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Abstract
5-hydroxytryptamine type-3 receptor (5-HT3) is a cation selective transmembrane pentamer whose functional stoichiometries and subunit arrangements are still debated. Five different 5-HT3R subunits, A to E, have been identified. Only the subunit A is capable of forming functional homopentameric receptors, while all the other subunits are apparently functional only if co-expressed with 5-HT3A. The 3D structure of any of the 5-HT3R subunits has not been solved as yet. Moreover, most of the available structural and functional data are related to the extracellular (ECD) ligand-binding domain, whereas the transmembrane (TMD) and the intracellular (ICD) receptor domains are far less characterised, although they are known to be crucial for receptor functionality. In addition, the 5-HT3R is an important target of many neuroactive drugs, among which palonosetron is a potent new generation 5-HT3 antagonist, whose mechanism of action is not yet fully understood. Recent computational studies suggest a possible second site of action in the ECD for palonosetron, hence stimulating further interest towards multivalency in the 5-HT3Rs. This thesis is aimed at getting new insights into the structural and functional features of the 5-HT3 system to deepen key aspects, still largely debated in the literature, such as the binding interface, the receptor multivalency and its functional stoichiometric composition. To this aim, a combined computational-experimental approach was envisaged. Docking studies of new antagonists into the 3D models of homomeric 5-HT3RAA binding interface previously modelled were performed to check whether the receptor could accommodate bivalent arylpiperazine-derivate ligands. The analysis of the binding modes identifies additional binding pockets that, together with the putative allosteric binding site found for palonosetron, might be a key issue in the comprehension of 5-HT3R functioning, since they further suggest that multivalency in 5-HT3R could involve receptor domains different from the main binding site. In order to verify the presence of the putative allosteric binding site, previously found for palonosetron, mutagenesis experiments were needed. These studies have been carried out in the Biochemistry laboratories of Dr. Sarah Lummis at the University of Cambridge (U.K.). A series of experimental mutations were performed: Tyr68, Phe125, Ser158, and Asp160 in the A subunit and His66, Phe123, Glu158, Tyr136 and Ile176 in the B subunit. Homomeric and heteromeric receptors were then expressed in HEK293 cells to determine the potency of palonosetron by both functional studies and radioligand binding. Data show that, among all the mutated residues, only Tyr68 may contribute to an alternative palonosetron binding site. The other residues may modify the receptor sensitivity. Finally, a physicochemical analysis of both the ECD and the TMD/ICD was performed with the aim of identifying factors which could influence the receptor stoichiometry. The electrostatic and hydrophobic potentials of the different 5-HT3R extracellular interfaces, computed on 3D homology models previously built, confirm the presence of an aromatic cluster located at the core of the AA interface as a key determinant for having an interface both stable and functional. Moreover, for the first time, 3D homology models of the TM/IC receptor domains of all the known human 5-HT3 subunits were built and assembled into homo- and heteropentameric receptors. From the comparative analyses of sequences, modelled structures and electrostatic properties, it emerges that the favourable environment that a Ca2+ ion encounters, when passing through the pore at the TM and IC domain levels, is granted by the fact that no more than two B subunits should be co-expressed in the 5-HT3 pentamer.
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