Riassunto analitico
Il pemfigo è una rara malattia bollosa della pelle di origine autoimmune. È caratterizzato dalla perdita di adesione dei cheratinociti (acantolisi) dovuta al legame di autoanticorpi (PVIgG) agli antigeni superficiali presenti sulle membrane dei cheratinociti. Nel pemfigo foliaceo (PF), le IgG patogene bersagliano la desmogleina 1 (Dsg1), mentre nel pemfigo volgare (PV) bersagliano la desmogleina 3 (Dsg3). Tuttavia, il pemfigo ha anche PVIgG diretti contro proteine non-desmosomiali come i recettori dell’acetilcolina (AChR), sia nicotinici (N) che muscarinici (M), ed i pazienti hanno forme cliniche diverse, basate sui vari antigeni coinvolti. Al fine di ricapitolare la composizione del pool di anticorpi prodotti da ciascun paziente con pemfigo e verificare se i vari tipi di PVIgG possano concorrere a causare acantolisi agendo sinergicamente, proponiamo un'evoluzione del modello murino attivo di pemfigo utilizzato solitamente per studiare questa malattia.
In primo luogo, utilizzando il sistema di espressione basato sui Baculovirus e sulle cellule d’insetto, abbiamo prodotto sei proteine ricombinanti murine (rDsg1, rDsg3, desmocollina 3 (rDsc3), rAChRM3, rAChRNα7 e rAChRNα9) che rappresentano i più importanti autoantigeni riconosciuti dai sieri dei pazienti con PV. Abbiamo immunizzato topi Dsg3-/- con la rDsg3 murina ed abbiamo trasferito i loro splenociti in topi immunodeficienti C57BL/6 Rag2-/- (Rag2) che esprimono la Dsg3. I topi riceventi producono in modo stabile le IgG anti-Dsg3 patogene e mostrano il fenotipo del PV mucosale. Abbiamo rotto la tolleranza immunologica immunizzando topi wild type (WT) con la rDsg1 e creato il modello murino attivo del PF attraverso il trasferimento in topi Rag2. Abbiamo anche creato un terzo modello murino (Dsg1/Dsg3) combinando gli splenociti derivati da topi immunizzati con la rDsg1 e topi immunizzati con la rDsg3 e quindi trasferendo il pool di cellule nei topi Rag2. Per valutare l'attività della malattia nei modelli murini, abbiamo utilizzato un PV score basato sull'ispezione visiva e la perdita di peso corporea, che è causata dall'inibizione dell'assunzione di cibo e riflette la portata delle erosioni orali. Abbiamo anche valutato la presenza di autoanticorpi nel siero dei topi Rag2 riceventi mediante ELISA. Inoltre, abbiamo testato il metilprednisolone (m-PSL), attualmente utilizzato per trattare i pazienti con PV, nel modello murino recentemente sviluppato. Il modello murino Dsg1/Dsg3 con il fenotipo più grave, riproduce i sintomi del PV mucocutaneo dei pazienti, così come lo stesso livello di distacco intraepiteliale e uguali depositi intercheratinocitari di IgG. Tutti i nostri modelli hanno risposto parzialmente al trattamento farmacologico.
I sieri dei pazienti con pemfigo contengono livelli più alti di fattori umorali rispetto ai sieri provenienti da soggetti sani. Per convalidare il ruolo di uno di questi fattori, abbiamo trattato i topi con pemfigo attivo con un nuovo farmaco sperimentale non immunosoppressivo che ha migliorato parzialmente la malattia.
Le immunizzazioni di topi WT con le altre proteine ricombinanti sono in corso, al fine di raggiungere il nostro obiettivo globale di ricreare modelli animali multipli (singoli, coppie e combinazioni di tre o più autoantigeni) che dovrebbero riflettere i vari fenotipi del pemfigo. In conclusione, abbiamo creato nuovi strumenti che migliorano la conoscenza dei patomeccanismi del pemfigo e serviranno per l'identificazione di nuovi bersagli terapeutici e la valutazione preclinica dell'efficacia di nuovi farmaci.
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Abstract
Pemphigus is a rare autoimmune bullous disease of the skin. It is characterized by loss of adhesion of keratinocytes (acantolysis) due to the bond of autoantibodies (PVIgG) to the surface antigens present on the keratinocyte membranes. In pemphigus foliaceus (PF), pathogenic IgG target desmoglein 1 (Dsg1), whereas in pemphigus vulgaris (PV) they target desmoglein 3 (Dsg3). Yet, pemphigus has PVIgG also directed against non-Dsg proteins such as acetylcholine receptors (AChR), both nicotinic (N) and muscarinic (M), and patients have different clinical forms, based on the various involved antigens. In order to recapitulate the composition of the pool of antibodies produced by each patient with pemphigus and to verify if various PVIgG species may concur to cause blistering by acting synergistically we propose an evolution of the active mouse model of pemphigus usually used to study this disease.
Using the Baculovirus Expression Vector System and insect cells, we produced six murine recombinant proteins (rDsg1, rDsg3, desmocollin 3 (rDsc3), rAChRM3, rAChRNα7 and rAChRNα9), which represent the most important autoantigens recognized by the sera of PV patients. We immunized Dsg3-/- mice with mouse rDsg3, and then adoptively transferred their splenocytes into C57BL/6 Rag2-/- (Rag2) immunodeficient mice that express Dsg3. Recipient mice stably produce the pathogenic anti-Dsg3 IgG and exhibit the phenotype of mucosal PV. In addition, we broke the immunological tolerance by immunizing wild type (WT) mice with rDsg1 and created the PF active mouse model through the adoptively transfer of splenocites into Rag2 mice. We also created a third mouse model (Dsg1/Dsg3) combining the splenocytes derived from mice immunized with rDsg1 and mice immunized with rDsg3 and then transferring the pool of cells to the Rag2 mice. To evaluate the disease activity in mouse models, we used a PV score, based on the visual inspection and body weight loss, which is caused by inhibition of food intake and reflects the extent of oral erosions. We also evaluated the presence of autoantibodies in the sera of recipient Rag2 mice by ELISA. Moreover, we tested methylprednisolone (m-PSL), currently used to treat patient with PV, in the newly developed mouse models. The Dsg1/Dsg3 mouse model with the most severe phenotype, reproduces symptoms of mucocutaneous PV in patients, as well as the same level of intraepithelial detachment and equal interkeratinocytic deposits of IgG. All our models responded partially to pharmacological treatment.
Sera from pemphigus patients contain higher level of humoral factors compared to sera from healthy subjects. To validate the role of one of these factors, we treated mice with active pemphigus with an experimental new non-immunosuppressive drug that partially improved the disease.
WT mice immunizations with the other recombinant proteins are underway, in order to achieve our global goal of recreating multiple animal models (individuals, couples, and combinations of three or more autoantigens) which should reflect the various phenotypes of pemphigus. In conclusion, we created new tools that improve the knowledge on pemphigus pathomechanisms and will serve for the identification of new therapeutic targets and to perform pre-clinical evaluations on the efficacy of new drugs.
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