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Il melanoma maligno (MM) è il tipo più mortale di cancro alla pelle a causa della sua aggressività e della sua resistenza alle comuni terapie. MM è una neoplasia complessa ed eterogenea caratterizzata da diverse popolazioni di cellule che mostrano differenze nelle caratteristiche genotipiche e fenotipiche, nelle vie di trasduzione del segnale, nel comportamento biologico e nella risposta alle terapie. Il microscopio confocale a riflettanza (RCM) analizza le caratteristiche del tumore a una risoluzione simile all’esame istologico. Questo approccio innovativo offre una finestra in tempo reale sul tessuto tumorale quando la lesione è ancora sulla pelle del paziente. RCM ha permesso l’identificazione di quattro tipi di MM: a cellule dentritiche (DC), a cellule rotonde (RC), con nidi nel Derma (DN) e il tipo combinato (CT). Noi ipotizziamo che i sottotipi di MM identificati all’RCM presentino un comportamento biologico diverso associato ad un diverso grado di aggressività, il quale potrebbe anche essere associato ad una diversa risposta alle terapie. Lo scopo di questo progetto è quello di studiare il profilo biomolecolare e cercare di capire il comportamento biologico dei sottotipi di MM. Abbiamo selezionato e valutato 85 melanomi al RCM. Li abbiamo poi caratterizzati dal punto di vista clinico, dermoscopico e istopatologico. I melanomi DC e RC erano generalmente a crescita radiale in stadio I e II; mentre CT e DN erano a crescita verticale, in stadio III e IV. Ki67 era significativamente più espresso nell’epidermide dei melanomi DC e RC. Al contrario, questo marker era maggiormente espresso nel derma nel DN, indicando una maggiore capacità invasiva di questo tipo di tumore. Nestina era maggiormente espressa nei CT rispetto ai DC. L’espressione di CD271 aumentava dai DC agli RC e diminuiva dagli RC agli CT. Questo correla con un nostro risultato precedentemente pubblicato in cui abbiamo visto che CD271 ha un comportamento “on/off” durante la progressione del melanoma. D’altra parte, l’espressione di ABCB5 era minore in RC rispetto a DC, CT e DN. La co-espressione di BMF e BRAFv600E è stata osservata in CT e DN, indicando un comportamento più aggressivo di CT e DN rispetto a DC. L’espressione di SOX2 è risultata essere inversamente correlata all’espressione di CD271 in tutti i sottotipi di MM. Successivamente, l’RNA estratto da tessuto di melanoma incluso in paraffina, è stato analizzato per l‘espressione di 770 geni con la tecnologia NanoString. Questa analisi ha rilevato significative differenze nell’espressione di geni coinvolti nella chemiotassi, infiammazione, adesione cellula-cellula, motilità cellulare e angiogenesi. Per comprendere il comportamento biologico dei sottotipi di MM, abbiamo deciso di eseguire studi in vitro e in vivo usando modelli di melanoma tri-dimensionali e lo Zebrafish. Per prima cosa, abbiamo osservato l’abilità degli sferoidi, derivati da cellule primarie di melanoma umano, di mantenere l’espressione di marker tumorali, e l’abilità degli “skin equivalent” di riprodurre il comportamento invasivo del tumore. Successivamente abbiamo messo a punto i modelli in vitro e in vivo per lo studio delle capacità proliferative e invasive dei sottotipi di melanoma e la loro risposta alle terapie. Questi risultati mostrano come sottotipi di MM selezionati all’RCM abbiano un diverso profilo biomolecolare. In particolare, abbiamo osservato un progressivo aumento nell’aggressività da DC verso il melanoma di tipo CT, mentre il sottotipo DN sembra avere un comportamento unico. Il nostro fine ultimo è quello di caratterizzare meglio questi sottotipi di melanoma con lo scopo finale di ottenere un approccio terapeutico più mirato al tipo di tumore.

Malignant melanoma (MM) is the deadliest type of skin cancer due to its aggressiveness and resistance to current therapies. MM is a complex and heterogeneous neoplasm characterized by several cell populations that show diverse genotypic and phenotypic features, signalling pathway, biological behaviour and response to therapy. Reflectance confocal microscopy (RCM) analyses features of the tumor at nearly histological resolution. This innovative approach offers an in vivo and in real time window into the tumor tissue when the lesion is still on patient’s skin. RCM allows the identification of four MM subtypes: dendritic-cell (DC), round cell (RN), dermal-nest (DN) and combined-type (CT). We hypothesize that MM RCM-subtypes present a different biological behaviour associated with a diverse degree of aggressiveness, which could also account for different response to therapy. The aim of this project was to study the bimolecular profile and try to understand the biological behaviour of MM RCM-subtypes. 85 MM were evaluated by RCM and characterized by clinical, dermoscopic and histopatological analyses. DC and RC melanoma were generally Radial Growth Phase in stage I and II, while CT and DN were Vertical Growth Phase in stage III and IV. Ki67 was significantly more expressed in epidermis in DC and RC. On the contrary, this marker was more expressed in the dermis in DN, indicating a greater invasive ability of this tumor type. Nestin was mainly expressed in CT rather than in DC. The expression of CD271 increased from DC to RC and decreased from RC to CT. This correlates with our previously published concept that CD271 has a “switch on-off” function in melanoma progression. On the other hand, ABCB5 expression was lower in RC than in DC, CT and DN. Co-expression of BMF and BRAFv660E was observed in CT, while inversely correlated in DC, RC and DN. Nestin and Sox2 were highly co-expressed in CT and DN, indicating a more aggressive behaviour of CT and DN than DC. SOX2 was inversely correlated with CD271 in all RCM-subtypes. Subsequently, RNAs extracted from paraffin-embedded melanoma tissues were analysed for the expression of 770 genes by NanoString technology. This analysis revealed significant differences in the expression of genes involved in chemotaxis, inflammation, cell-cell adhesion, cell motility and angiogenesis. In order to understand the biological behaviour of RCM melanoma subtypes, we decided to perform in vitro and in vivo study by using 3D melanoma models and zebrafish. Firstly, we observed the ability of 3D multicellular spheroids, derived from primary human melanoma, to maintain the expression of tumor markers, and the ability of skin equivalents to reproduce invasive behavior of the tumor. Subsequently, we set up the model in vitro and in vivo in order to study the proliferative and invasive capacity of RCM melanoma subtypes and their response to therapy. Taken together these results show that MM RCM-subtypes have a different biomolecular profile. In particular, we observed a progressive increase in aggressiveness from DC to CT MM subtypes, while DN showed a unique behaviour. We believe that these study will allow to better characterize these melanoma subtypes with the final aim of reaching a more accurate patient/tumor tailored therapeutic approac.