Riassunto analitico
La mielofibrosi primaria (PMF) è una neoplasia mieloproliferativa BCL-ABL1-negativa (MPNs) caratterizzata da una marcata sintomatologia, tra cui ematopoiesi extramidollare principalmente a carico della milza e fibrosi del midollo osseo. Le MPNs sono caratterizzate da uno stato di infiammazione cronica, supportato da un alto livello di citochine pro-infiammatorie (tra cui transforming growth factor- β1, TGF-β1) e di specie reattive dell’ossigeno (ROS) in parte responsabili dell’avanzamento della malattia. In particolare, la PMF deriva dalla trasformazione della cellula staminale emopoietica e dalla sua conseguente espansione che porta a una deregolata proliferazione di megacariociti displastici e granulociti. Recentemente, molti studi hanno evidenziato l’importanza dei microRNA (miRNA) e della loro deregolata espressione nella malattia. Con l’intento di chiarire i meccanismi molecolari alla base della patogenesi della PMF, abbiamo eseguito un’analisi di espressione di miRNA in cellule staminali emopoietiche CD34+ provenienti da pazienti di PMF, che ci ha permesso di identificare miR-382-5p come miRNA up-regolato in questa patologia. In seguito, per chiarire il ruolo di miR-382-5p nell’emopoiesi normale, abbiamo eseguito esperimenti di overespressione in cellule CD34+ isolate da sangue cordonale. Inizialmente abbiamo dimostrato che l’overespressione del miR-382-5p in cellule CD34+ favorisce l’espansione della linea granulocitaria. Per meglio identificare il ruolo di miR-382-5p nella patogenesi della PMF, abbiamo analizzato il profilo di espressione genica di cellule CD34+ overesprimenti il miRNA. Tra i geni down-regolati dopo overespressione del miR-382-5p, abbiamo selezionato l’enzima antiossidante SOD2 (superoxide dismutase 2), che risulta essere il target putativo più favorevole secondo quanto riportato dal database TargetScanHuman. Dopo aver confermato che SOD2 è un reale target di miR-382-5p tramite saggio di luciferasi, abbiamo dimostrato che l’overspressione di miR-382-5p in cellule CD34+ normali causa una riduzione sia dell’espressione sia dell’attività di SOD2. Inoltre, abbiamo evidenziato che miR-382-5p induce l’accumulo di ROS, causa danno al DNA e favorisce la proliferazione cellulare. Successivamente, per confermare il ruolo di miR-382-5p nella patogenesi della PMF, abbiamo inibito la sua espressione in cellule CD34+ di paziente. I nostri risultati mostrano che il silenziamento di miR-382-5p ripristina l’espressione e l’attività di SOD2, riduce la produzione di ROS e il danno al DNA; inoltre compromette la capacità proliferativa delle cellule CD34+. In seguito, per correlare miR-382-5p all’infiammazione cronica, tipica della PMF, abbiamo trattato cellule CD34+ cordonali con TGF-β1, già in precedenza descritto come citochina pro-infiammatoria coinvolta nella patogenesi della PMF. Abbiamo quindi dimostrato che il TGF-β1 induce l’espressione del miR-382-5p, causando la riduzione dell’espressione e dell’attività della SOD2 e portando a un aumento della produzione di ROS. Infine, per confermare il ruolo dell’asse TGF-β1/miR-382-5p/SOD2 nell’induzione dello stress ossidativo, abbiamo inibito il pathway di TGF-β1 in cellule CD34+ di PMF con Galunisertib, un noto inibitore dell’attività del recettore I del TGF-β1. Il trattamento causa una riduzione dell’espressione di miR-382-5p, ripristinando l’attività e l’espressione di SOD2. Galunisertib inoltre riduce la produzione di ROS in cellule CD34+ di PMF rispetto al controllo dopo 24 ore di trattamento. In conclusione, in questo lavoro abbiamo descritto per la prima volta il ruolo dell’asse TGF-β1/mir-382-5p/SOD2 nell’over-produzione di ROS e identificato la potenziale efficacia terapeutica di Galuniserib nel ridurre lo stress ossidativo sostenuto dagli alti livelli di TGF-β1 in pazienti affetti da PMF.
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Abstract
Primary myelofibrosis is a chronic BCR-ABL1-negative myeloproliferative neoplasm (MPN) defined by several clinical hallmarks, including splenomegaly due to extramedullary hematopoiesis and bone marrow (BM) fibrosis. MPNs may be preceded or accompanied by chronic inflammation, supported by high level of pro-inflammatory cytokines (i.e., transforming growth factor- β1, TGF-β1) and excessive generation of Reactive Oxygen Species (ROS) that are, at least in part, responsible for disease progression. In particular, PMF arises from an acquired stem cell genetic lesion and subsequent clonal expansion that leads to the accumulation of dysplastic megakaryocytes and granulocytes. Recently, extensive studies have provided unambiguous evidences that deregulated expression of microRNAs (miRNAs) may play a role in MPN’s pathogenesis.
In order to shed light on the molecular mechanism underlying PMF pathogenesis, we recently analysed the miRNA expression profile in CD34+ hematopoietic stem/progenitor cells (HSPCs) from PMF patients, which allowed us to identify miR-382-5p as up-regulated miRNA. With the aim to assess the role of miR-382-5p in normal haematopoiesis, we carried out overexpression experiments in human cord blood (CB)-derived CD34+ cells, using a mirVana miR-382-5p mimic.
First, we demonstrated that enforced miR-382-5p expression in normal CD34+ cells favours the expansion of granulocyte lineage. Then, to better establish the role of miR-382-5p in PMF pathogenesis, we performed a gene expression profile in CB CD34+ cells overexpressing miR-382-5p by means of Affymetrix microarray platform. Among the down-regulated genes, we pointed out the anti-oxidant superoxide dismutase 2 (SOD2), depicted as the most favourable predicted target according to TargetScanHuman Database. Once confirmed that SOD2 is a real miR-382-5p target by luciferase reporter analysis, we showed that miR-382-5p overexpression reduced SOD2 expression and activity in CD34+ cells. Furthermore, we demonstrated that miR-382-5p induced ROS accumulation, increased DNA damage and enhanced CD34+ cells proliferation.
Afterwards, to confirm that miR-382-5p plays a role in PMF pathogenesis, we performed inhibition experiments in PMF CD34+ cells by means of miR-382-5p antagomiR. Our data showed that miR-382-5p silencing restored SOD2 expression and activity, induced ROS disposal, decreased DNA oxidation and impaired cell proliferation.
Then, to verify whether miR-382-5p could be related to chronic inflammatory state typical of PMF, we treated CD34+ cells with TGF-β1, already described as cytokine up-regulated in PMF serum, and involved in disease pathogenesis. We showed that TGF-β1 treatment induced miR-382-5p expression, which in turn suppresses SOD2 activity leading to ROS over-production.
Finally, to further confirm the involvement of the axis TGF-β1/miR-382-5p/SOD2 in the induction of oxidative stress, we inhibited TGF-β1 pathway in PMF CD34+ cells using Galunisertib, a specific TGF-β-receptor I kinase inhibitor. We showed that TGF-β1 inhibition reduced miR-382-5p expression, restoring SOD expression and activity. Of note, Galunisertib significantly reduced ROS accumulation in PMF CD34+ cells as compared to untreated sample.
Taken together, our results unveiled the role of the axis TGF-β1/miR-382-5p/SOD2 in ROS overproduction, further contributing to a state of chronic inflammation. Moreover, we pointed out the potential therapeutic efficacy of Galunisertib in reducing oxidative stress sustained by increased level of TGF-β1 in PMF CD34+ cells.
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