Riassunto analitico
La Mielofibrosi Primaria (PMF) fa parte delle Neoplasie Mieloproliferative Philadelphia-negative (MPNs) e presenta mieloproliferazione clonale delle cellule staminali emopoietiche che coinvolge principalmente la linea megacariocitaria. Per comprendere meglio il ruolo dei microRNA (miRNA) nello sviluppo della PMF abbiamo analizzato i profili di espressione genica e dei miRNA in progenitori emopoietici CD34+ di PMF. L'analisi integrata dei profili di espressione ha evidenziato miR-494-3p come il miRNA overespresso in CD34+ di PMF associato al maggior numero di target predetti la cui espressione è downregolata.
Per studiare il ruolo di miR-494-3p nel differenziamento emopoietico lo abbiamo overespresso in cellule CD34+ normali. I risultati hanno dimostrato che l'overespressione di miR-494-3p promuove la megacariocitopoiesi nelle cellule CD34+. Lo studio dei profili di espressione genica delle cellule overesprimenti miR-494-3p ha rivelato la presenza di un set di geni downregolati sia dopo overespressione del miRNA che in cellule CD34+ di PMF. Tra questi, Suppressor of Cytokine Signaling 6 (SOCS6) è risultato essere il target più probabile di miR-494-3p secondo quanto riportato da diversi algoritmi di predizione. I saggi reporter di luciferasi hanno confermato l'interazione tra miR-494-3p e l'mRNA di SOCS6, che risulta downregolato sia a livello messaggeriale che proteico dopo overespressione del miRNA. Abbiamo inoltre dimostrato l'attivazione di STAT3 nelle cellule overesprimenti miR-494-3p, suggerendo che il miRNA agisca sulla via JAK/STAT mediante l'inibizione di SOCS6.
In seguito abbiamo studiato il ruolo di SOCS6 nel differenziamento emopoietico mediante esperimenti di silenziamento su CD34+ normali, che hanno dimostrato che il silenziamento di SOCS6 stimola la megacariocitopoiesi al pari di quanto osservato dopo l'overespressione di miR-494-3p. Infine, per chiarire il contributo di miR-494-3p nello sviluppo della PMF, abbiamo effettuato esperimenti di silenziamento in cellule CD34+ di PMF che hanno confermato come l'inibizione del miRNA determini un aumento nell'espressione di SOCS6 e una riduzione del differenziamento megacariocitario.
I nostri risultati hanno quindi dimostrato che l'aumentata espressione di miR-494-3p potrebbe giocare un ruolo fondamentale nella patogenesi della PMF. Nonostante un numero crescente di lavori abbia dimostrato che diverse condizioni patologiche, tra cui il cancro, influenzano l'espressione dei miRNA nei fluidi corporei, ad oggi sono poche le informazioni riguardanti l'espressione dei miRNA circolanti nelle MPNs. Per indagare questo aspetto, abbiamo valutato i livelli di espressione di un pannello di 224 miRNA circolanti, già descritti come associati a diverse neoplasie, nel plasma di 52 pazienti di PMF e 20 controlli sani. Mediante real time RT-qPCR abbiamo individuato 56 miRNA differenzialmente espressi tra i pazienti di PMF ed i controlli. In particolare, abbiamo osservato che questa lista comprende, oltre a miR-494-3p, 16 miRNA la cui espressione risulta essere deregolata anche nelle cellule CD34+ di PMF.
Nell'insieme i nostri risultati descrivono per la prima volta il ruolo di miR-494-3p nell'emopoiesi e suggeriscono che l'aumento della sua espressione e la conseguente downregolazione di SOCS6 nelle cellule CD34+di PMF, potrebbe favorire l'iperplasia megacariocitaria comunemente osservata nei pazienti di PMF.
Inoltre, l'analisi dell'espressione dei miRNA circolanti ha confermato la presenza di alti livelli di miR-494-3p anche nel plasma dei pazienti con PMF, suggerendo che miR-494-3p potrebbe essere considerato come un nuovo marker di malattia.
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Abstract
Primary Myelofibrosis (PMF) is a chronic Philadelphia-negative Myeloproliferative Neoplasm (MPN) characterized by hematopoietic stem cell-derived clonal myeloproliferation, involving especially the megakaryocyte (MK) lineage, bone marrow fibrosis and extramedullary hematopoiesis. Increasing number of studies suggest that alterations in microRNAs (miRNAs) expression could play a critical role in MPN’s pathogenesis. To better characterize how microRNAs might contribute to PMF pathogenesis, we have previously performed the integrative analysis (IA) of gene and miRNA expression profiles of PMF hematopoietic stem/progenitor cells (HSPCs). IA identified miR-494-3p as the upregulated miRNA associated to the highest number of downregulated predicted targets in HSPCs.
In order to study the role of miR-494-3p in hematopoietic differentiation we performed overexpression experiments in cord blood (CB) CD34+ HSPCs through miRNA mimic electroporation. Immunophenotypic and morphological analysis, together with clonogenic assays, demonstrated that miR-494-3p enforced expression promotes megakaryocytopoiesis in CD34+ HSPC. Gene expression profile upon miR-494-3p overexpression revealed a set of genes commonly downregulated both after miRNA overexpression and in PMF CD34+ HSPC. Among them, Suppressor of Cytokine Signaling 6 (SOCS6) turned out as the miR-494-3p predicted target associated to the most favorable prediction scores according to different prediction algorithms. 3' UTR luciferase reporter assays proved the interaction between miR-494-3p and SOCS6 3'UTR, as well as real time RT-qPCR and western blot analysis (WB) confirmed the downregulation of the target upon miRNA overexpression. Furthermore, WB analysis revealed STAT3 activation in miR-494-3p overexpressing cells suggesting that this miRNA can modulate JAK/STAT signaling by inhibiting SOCS6 expression.
Next, we studied the role of SOCS6 in HSPCs differentiation by silencing its expression in CB CD34+ cells. Transient inhibition of SOCS6 expression in HSPCs stimulates megakaryocytopoiesis mimicking the phenotypic effects observed upon miR-494-3p overexpression. Finally, to disclose the contribution of miR-494-3p upregulation to PMF pathogenesis, we performed inhibition experiments in PMF CD34+ HSPCs by means of miR-494-3p inhibitors. As a result, miR-494-3p silencing led to SOCS6 upregulation and impaired MK differentiation in PMF HSPCs.
Therefore, our results demonstrated that deregulated expression of miR-494-3p might play a crucial role in the pathogenesis of PMF.
Despite growing evidences have shown that pathologic conditions, such as cancer, may impact the spectrum of extracellular miRNAs in body biofluids, to date little is known about circulating miRNAs in MPN patients. In order to look into this issue, we evaluated the expression levels of a custom panel composed of 224 cancer related circulating miRNAs in 72 plasma samples from 52 PMF patients and 20 healthy controls. High throughput real time RT-qPCR identified a signature of 56 differentially expressed miRNAs that can distinguish PMF samples from controls. Of note, among them, we found miR-494-3p and other 15 miRNA that were deregulated also in PMF CD34+ cells according to our previous results.
Taken together, our results describe for the first time the role of miR-494-3p during normal HSPC differentiation and indicate that its increased expression, and the subsequent downregulation of its target SOCS6, might contribute to MK hyperplasia commonly observed in PMF patients. Interestingly, circulating miRNA analysis confirmed the upregulation of miR-494-3p also in PMF plasma samples suggesting its possible use as disease biomarker.
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