Riassunto analitico
Il recupero di difetti scheletrici significativi potrebbe essere parzialmente abortivo a causa delle perturbazioni che influenzano il processo rigenerativo. Quando si verifica una frattura è possibile incorrere in un cosiddetto difetto di dimensioni critiche (CSD), una grave lesione ossea che impedisce al segmento scheletrico di autoripararsi.
Gli attuali trattamenti standard comprendono l'allotrapianto, l'autotrapianto e altre tecniche di impianto osseo. Tuttavia, sebbene siano comunemente usati nella chirurgia ortopedica, questi trattamenti hanno alcune limitazioni riguardo ai loro costi e ai loro effetti collaterali come potenziali infezioni o pseudoartrosi. L'ingegneria dei tessuti ha diretto i suoi sforzi nello sviluppo di nuovi scaffolds per combinare appropriati modelli cellulari e stimoli, allo scopo di riprodurre l'interazione tra cellule e matrice extracellulare durante il processo di osteogenesi.
Per questo motivo, è ancora urgente la necessità di costrutti adeguati per colmare il divario osseo in ampie fratture. In particolare, molti scaffolds sono stati sviluppati con proprietà diverse, proponendo nuovi materiali da utilizzare per nuove tecniche di stampa 3D al fine di innescare l'inizio della rigenerazione ossea e ottimizzare la crescita cellulare; sono stati testati diversi stimoli chimici o fisici esogeni, come fattori solubili di crescita / differenziazione e l'applicazione di forze meccaniche (ad esempio il carico); infine, molti tipi di cellule sono stati usati da soli o in co-coltura.
Come soluzione innovativa, gli ossicini sclerali (OSs) possono essere suggeriti come scaffolds naturali per la riparazione delle ossa. Gli OSs sono delle particolari placche ossee che formano un anello sul bordo sclerale-corneale del bulbo oculare dei vertebrati inferiori (ottenuto, in questo caso, dal pollo). Questo modello proposto è interessante perché una volta che gli OS raggiungono la dimensione definitiva, nell'animale adulto, sono sottoposti a stress meccanico stereotipato per tutta la vita, con il solo scopo protettivo; pertanto, i processi di rimodellamento osseo devono essere evitati e, per fare ciò, gli osteociti subiscono un'apoptosi massiva, rendendo gli ossicini simili alle ossa decellularizzate.
Gli obiettivi di questa tesi sono: (1) caratterizzare la morfologia del materiale naturale peculiare proposto, (2) testare la biocompatibilità degli OS attraverso approcci in vitro e in vivo, (3) testare il potenziale angiogenico degli OS e infine, (4) verificare l'assenza di potenziale infiammatorio a seguito di impianto sottocutaneo.
Tra i metodi utilizzati, il test della Membrana Corio-Allantoidea (CAM) è stato in grado di testare il potenziale angiogenico degli OS (poiché la neo-angiogenesi è un prerequisito essenziale per la rigenerazione ossea) e il modello di ratto è stato utilizzato per verificare la loro biocompatibilità (poiché è importante non indurre alcuna reazione avversa dell'ospite). I risultati hanno mostrato una buona biocompatibilità degli OS e la capacità di innescare una reazione neo-vascolare estremamente vistosa.
Come prospettive future, la nostra proposta di ricerca mira a produrre un costrutto composto da due parti: i) un bio-scaffold funzionalizzato formato da ossicini sclerali, tra cui rete vascolare e cellule osteogeniche e ii) una matrice dinamica stampata in 3D che costituisce un traliccio (che occupa l’intero gap osseo) che ospita gli OS. L'obiettivo finale è quello di accelerare il processo rigenerativo utilizzando OS inclusi all'interno della matrice dinamica 3D che, a sua volta, fungerà da "modello attivo" al fine di diffondere il tessuto appena formato lungo l'intero spazio della frattura.
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Abstract
Recovering of significant skeletal defects could be partially abortive due to the perturbations that affect the regenerative process. When a fracture occurs it is possible to incur in a so called critical-size defect (CSD), a severe bone lesion that prevents the skeletal segment from self-repairing.
The current standard treatments include allografting, autografting, and other bone implant techniques. However, although they are commonly used in orthopedic surgery, these treatments have some limitations concerning their costs and their side effects such as potential infections or nonunion. The tissue engineering directed its efforts in developing new scaffolds to combine cell models and appropriate stimuli with the aim to reproduce the interaction between cells and extracellular matrix during the osteogenesis process.
On this account, the need for suitable constructs to fill the bone gap in wide fractures is still urgent. In particular, many different scaffolds have been developed with different properties, proposing new materials to be used for new 3D printing techniques in order to trigger the onset of bone regeneration and optimize the cell growth; a variety of different exogenous chemical or physical stimuli were tested, such as soluble growth/differentiation factors as well as the application of mechanical forces (for example, loading); finally, many types of cells have been used alone or in co-culture.
As an innovative solution, scleral ossicles (SOs) can be suggested as natural scaffolds for bone repair. SOs are peculiar bony plates forming a ring at the scleral-corneal border of the eyeball of lower vertebrates (obtained, in this case, from chicken). This proposed model is interesting because once SOs reach the definitive size, in the adult animal, they are subjected to mechanical stereotyped stress for their lifetime, with sole protective purpose; therefore, the bone remodeling processes must be avoided and, to do this, the osteocytes undergo massive apoptosis, making the ossicles like decellularized bones.
The aims of this thesis are: (1) characterize the morphology of the proposed peculiar natural material, (2) assay the biocompatibility of the SOs through both in vitro and in vivo approaches, (3) assay the SOs angiogenic potential and finally, (4) verify the absence of inflammatory potential upon its subcutaneous implantation.
Among the methods used, the Chorioallantoic Membrane (CAM) assay was able to test the angiogenic potential of the SOs (since neo-angiogenesis is essential prerequisite for bone regeneration) and rat model has been used to verify the SO biocompatibility (since it is important to not induce any adverse host reaction). The results showed good biocompatibility of SOs as well as ability in triggering extremely flashy neo-vascular reaction.
As future perspectives, our research proposal aims at manufacturing a construct composed of two parts: i) a functionalized bio-scaffold formed by scleral ossicles, including vascular network and osteogenic cells and ii) a 3D printed dynamic matrix constituting a trellis (which occupies the entire bone gap) housing the SOs. The final goal is to speed up the regenerative process by SOs included inside the 3D dynamic matrix that, in turn, will act as an “active template” in order to spread the newly formed tissue along the entire gap of the fracture.
Scleral ossicles,, , , Subcutaneous implant
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