Riassunto analitico
Le mutazioni del gene della nucleofosmina (NPM1) rappresentano una delle lesioni molecolari più frequenti nella leucemia mieloide acuta (LMA). Le mutazioni NPM1 sono specifiche e sono solitamente espresse in tutta la popolazione leucemica. Esse provocano cambiamenti strutturali del C-terminale della proteina, con successiva delocalizzazione citoplasmatica aberrante, portando a perturbazioni di vie cellulari critiche per la leucemogenesi. Tale dislocazione di NPM1 può anche favorire la processazione e degradazione delle proteine, presumibilmente portando ad una presentazione più efficiente da parte del complesso HLA. Nessuna delle sequenze umane normali presenti nelle banche dati corrisponde a quella degli 11 residui C-terminali della proteina NPM1 mutata (NPM1-mut), suggerendo che questa sequenza aminoacidica possa fungere da antigene leucemia-specifico. A tal proposito, Liso et al. hanno valutato la capacità di legame in silico e in vitro di peptidi derivati da NPM1-mut alle molecole HLA, documentando un'efficacia di legame di due peptidi derivati dalle mutazioni A e D alle molecole HLA-A2. Inoltre, in uno studio di Greiner et al. l'intera sequenza aminoacidica della proteina NPM wild-type e mutata (tipo A, B, C, D) è stata analizzata per individuare gli epitopi T cellulari con capacità di legame con HLA-A*0201. Le risposte immunitarie peptide-specifiche ex vivo sono state valutate mediante saggio immunologico enzyme-linked immunospot (ELISPOT) per la secrezione di interferone-γ (IFN-γ) e granzyme B. Oltre al verificarsi di risposte immunitarie specifiche da parte di cellule T CD8 + e CD4 + verso epitopi di NPM1-mut, gli autori hanno inoltre documentato l'attività citotossica dei T CD8 + sia contro cellule T2 peptide-pulsate che su blasti leucemici primari NPM1-mut. Inoltre, in un'analisi di sopravvivenza di 25 pazienti affetti da LMA NPM1-mut, è stata osservata una migliore sopravvivenza globale per i pazienti che presentano risposte T cellulari NPM1-mut specifiche, rispetto ai casi senza risposta immunitaria specifica. Lo scopo del nostro studio è stato quello di esaminare le dinamiche delle risposte T cellulari NPM1-mut specifiche su campioni di sangue periferico (SP) e di midollo osseo (MO) raccolti da 31 pazienti con LMA NPM1-mut in diverse fasi di malattia e stimolate con mix di 18 peptidi brevi e lunghi (9-18mer), derivati dalla regione completa del C-terminale di NPM1-mut. Gli epitopi più immunogenici sono risultati due peptidi 9-mer, nel dettaglio LAVEEVSLR e AVEEVSLRK (13.9-14.9). Linfociti T NPM1-mut-specifici produttori di IFNγ sono stati osservati mediante ELISPOT dopo stimolazione con i peptidi 13.9-14.9 in 34/80 (42.5%) campioni di MO e in 43/85 (50.6%) di SP. Risposte significativamente più elevate sono state riscontrate nei campioni di SP, nei pazienti di età inferiore ai 60 anni e dopo trapianto allogenico. È stata osservata una correlazione inversa tra la cinetica della malattia minima residua e le cellule T specifiche anti-leucemiche. I profili di produzione citochinica e di memoria hanno documentato cellule T specifiche-NPM1 mut producenti principalmente IFNγ e IL2, rispettivamente con fenotipo prevalentemente Effector Memory e Central Memory. Inoltre, i linfociti T citotossici specifici-NPM1 mut possono essere espansi ex vivo da pazienti con LMA NPM1-mut o da donatori sani sensibilizzati. Il saggio di citotossicità al Cr51 ha documentato la capacità dei peptidi 13.9-14.9 combinati con il peptide 15.11 (CLAVEEVSLRK), di indurre attività citolitica contro blasti leucemici primari o blasti-PHA pulsati con diverse miscele di peptidi. I nostri dati documentano la presenza spontanea e la persistenza di cellule T specifiche-NPM1 mut, che possono contribuire a mantenere remissioni durature di malattia.
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Abstract
Nucleophosmin (NPM1) gene mutations represent one of the most frequent molecular lesions observed in acute myeloid leukemia (AML). NPM1 mutations are specific, being almost exclusively restricted to AML, and usually expressed in the whole leukemic population. NPM1 mutations result in structural changes of the C-terminus of NPM1 protein, with subsequent aberrant cytoplasmic delocalization, leading to perturbations of multiple cellular pathways, critical for leukemogenesis. Most importantly, the NPM1 cytoplasmic dislocation may also favor the protein processing and degradation pathways, presumably leading to more efficient human leukocyte antigen (HLA) presentation. Of note, none of normal human sequences present in databanks matches that of the 11 C-terminal residues of the NPM1 mutants, suggesting that this aminoacidic sequence may serve as a leukemia-specific antigen.
Relevant to this, Liso et al. previously investigated the ability of candidate NPM1-mutated peptides to bind common HLA molecules in silico and in vitro, documenting efficiently binding of two peptides derived from NPM1 mutations A and D to HLA-A2 molecules. Furthermore, in a study by Greiner et al. the entire aminoacid sequences of the wild-type and mutated (types A, B, C, D) NPM1 protein were screened for HLA-A*0201-binding T-cell epitopes using several software programs. The ex vivo peptide-specific immune responses were evaluated on the basis of interferon-γ (IFN-γ) and granzyme B production by enzyme-linked immunospot (ELISPOT) assay. In addition to the occurrence of specific immune responses by CD8+ and CD4+ T cells against epitopes derived from NPM1-mutated protein, the authors also documented cytotoxic activity of CD8+ T cells against either peptide-pulsed T2 cells or primary NPM1-mutated leukemic blasts. Intriguingly, in a survival analysis of 25 patients affected with NPM1-mutated AML, a better overall survival was observed for patients showing NPM1-mutated-specific T-cell responses, compared with cases without specific immune response, suggesting that immune responses against the mutated region of NPM1 may potentially contribute to the favorable clinical outcome of NPM1-mutated AML patients.
In the current study, we investigated the dynamics of NPM1-mutated-specific T cells on PB and bone marrow (BM) samples, collected from 31 adult NPM1-mutated AML patients throughout the disease course, and stimulated with mixtures of 18 short and long peptides (9-18mers), derived from the complete spanning of C-terminal of NPM1-mutated protein. Two 9-mer peptides, namely LAVEEVSLR and AVEEVSLRK (13.9-14.9), were identified as the most immunogenic epitopes. IFNγ-producing NPM1-mutated-specific T cells were observed by ELISPOT assay after stimulation with peptides 13.9-14.9 in 34/80 (42.5%) BM and 43/85 (50.6%) PB samples. Significantly higher responses were found in PB samples, in patients younger than 60 years and following allogeneic HSCT. An inverse correlation between kinetics of MRD and anti-leukemic specific T cells was observed. Cytokine production and memory profiles documented NPM1-mutated-specific T cells, mainly producing IFNγ and IL2. Either Effector Memory or Central Memory T cells were predominantly identified among IFNγ–producing and IL2–producing T cells, respectively. Moreover, NPM1-mutated-specific CTLs can be ex vivo expanded from NPM1-mutated AML patients or primed in healthy donors. Cr51-release assays showed the ability of 13.9-14.9 peptides combined with CLAVEEVSLRK (peptide 15.11), to induce cytolytic activity against primary leukemic blasts or PHA-blasts pulsed with different peptide pools. We described spontaneous occurrence and persistence of NPM1-mutated-specific T cells, which may contribute to maintain long-lasting remissions.
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