Riassunto analitico
L’Epidermolisi Bollosa (EB) è una rara malattia genetica della pelle, causata da mutazioni in geni codificanti diverse proteine della giunzione dermo-epidermica (tra cui LAMB3, COL7A1, COL17A1). L’EB è caratterizzata da fragilità meccanica e strutturale della pelle e delle mucose. Nel 2006, un approccio combinato di terapia cellulare e genica, basato sulla correzione ex-vivo mediata dal retrovirus MLV (murine leukemia virus), ha rappresentato il primo approccio di terapia genica per l’Epidermolisi Bollosa giunzionale (JEB). Tale epidermide, trapiantata stabilmente, si mantiene da oltre 12 anni, in modo funzionale, rinnovandosi in assenza di ricomparsa del fenotipo malattia. Recentemente abbiamo riportato di una terapia salva-vita che ha rigenerato l’intera epidermide di un bambino di 7 anni affetto da una forma molto severa di EB giunzionale (JEB). La dimostrazione dell’attuabilità, dell’efficacia e della sicurezza di questa terapia cellulare e genica ha incoraggiato lo sviluppo di tecnologie simili per trattare altre forme di EB.
Sebbene i pazienti trattati non abbiano mostrato la comparsa di eventi avversi durante gli anni del follow-up, è stato opportuno sviluppare dei saggi biologici preclinici volti a valutare la sicurezza della suddetta terapia. Oltre ai classici saggi di sicurezza, abbiamo sviluppato un nuovo saggio biologico basato sulla “coltivazione seriale” dei cheratinociti umani primari trasdotti. Per testare le cellule clonogeniche potenzialmente immortalizzate o trasformate, abbiamo coltivato l’intera popolazione di cellule trasdotte con gli MLV per un numero indefinito di passaggi fino al raggiungimento della senescenza replicativa. Questo saggio, oltre a valutare potenziali eventi di mutagenesi inserzionale, pone le cellule sotto un forte stress proliferativo.
Durante la coltivazione seriale di 18 campioni di cheratinociti di pazienti EB corretti geneticamente (un totale di circa 6,6 x 106 cellule clonogeniche), abbiamo notato lo sviluppo di 7 cloni immortalizzati. Nello specifico, 5 di questi cloni immortalizzati sono non trasdotti e solo 2 di questi contengono la correzione genica. All’interno della valutazione dei test preclinici di sicurezza, abbiamo quindi condotto un’analisi sui siti d’integrazione retrovirali, all’interno del DNA estratto dai due cloni contenenti il trasgene, tramite LM-PCR. Grazie a questo approccio, sono state riscontrate 3 integrazioni indipendenti, mappate in modo chiaro all’interno dei cromosomi umani.
Nello specifico, 1 integrazione è stata classificata come intergenica, 1 integrazione si trova dentro la sequenza intronica del gene SMARCAL1 ed 1 integrazione è inserita a meno di 10Kb a monte del sito di inizio di trascrizione del gene SLMAP. Tramite PCR quantitativa e analisi proteica è stato dimostrato come i due geni siano egualmente espressi nei cheratinociti di controllo e nei cloni trasdotti.
Questi dati mostrano dunque che nessun evento immortalizzante è correlato alle integrazioni del provirus nei cheratinociti trasdotti con MLV-RV coltivati in modo seriale.
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Abstract
Epidermolysis Bullosa (EB) is a group of devastating, sometimes early lethal, genetic disorders caused by mutations in genes encoding for different proteins of the epidermal-dermal junction (LAMB3, COL7A1, COL17A1). EB is characterized by structural and mechanical fragility of the skin and mucosal membranes. In 2006, a combined cell and gene therapy approach, based on ex vivo MLV-retroviral-mediated gene correction, has been established and it represented the first gene therapy approach for a Junctional form of EB (JEB). A stable, functional, renewing and no-blistering epidermis was maintained over 12 years of follow-up. We recently reported life-saving regeneration of the entire epidermis on a seven-year-old JEB child suffering from a devastating form of JEB. The demonstration of feasibility, efficacy and safety of this cell-gene therapy strategy has encouraged the development of similar technologies to target other forms of EB.
Although these patients did not show adverse events during the entire follow-up, it is desirable to develop robust pre-clinical safety assays. In addition to standard safety assay, we thus developed a new biological assay based on serial cultivation of transduced keratinocytes. To test for potential immortalized or transformed clonogenic cells, we have cultivated the entire MLV-RV-transduced population of cells for an undefined number of passages up to the onset of replicative senescence. This assay, in addition to the potential insertional mutagenesis, poses a strong proliferative stimulus on the cells.
During serial cultivation of 18 transduced and untransduced EB keratinocyte strains (a total of approximately 6,6 x 106 clonogenic cells), we noticed the development of 7 immortal clones. Strikingly, 5 immortal clones were untransduced and only 2 clones contained the transgene.
As part of the safety assessment of the pre-clinical assays, we carried out an analysis of the retroviral integration sites on DNA extracted from the 2 clones contained the transgene by LM-PCR. By this approach, 3 independent integrations were unambiguously mapped on human chromosomes.
Overall, 1 integration was classified as intergenic, 1 was within the intronic sequence of SMARCAL1 gene and 1 integration occurred < 10kb upstream from the transcription starting site of SLMAP gene. Quantitative PCR and protein analysis showed that SMARCAL1 and SLMAP were equally expressed in control keratinocytes and in transduced clones.
These data show that we could not detect any immortalization events related to specific proviral integrations in many serially cultivated MLV-RV-transduced keratinocytes.
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