Riassunto analitico
Le mutazioni che coinvolgono il gene Rodopsina (RHO) rappresentano un’importante causa di sviluppo della cecità. Il 25-30% di tali mutazioni è caratterizzato da mutazioni dominanti associate alla Retinite Pigmentosa (adRP), mentre la restante parte rappresenta l’8-10% di tutte le RP. In adRP la mutazione su un singolo allele è sufficiente per lo sviluppo della malattia. Per questa ragione, lo sviluppo del sistema CRISPR/Cas9 come strumento genico per silenziare in modo specifico l’allele difettivo RHO rappresenta un valido approccio terapeutico. La nucleasi Cas9 induce un doppio taglio del DNA principalmente mediante l’introduzione di inserzioni/delezioni (InDels) a livello della regione bersaglio portando ad un silenziamento genico permanente. In questo studio è stata analizzata l’efficacia e la specificità della S.pyogenes Cas9 (Cas9) e della variante high-fidelity VQR (Cas9-VQRHF1) per inattivare la mutazione dominante RHO P347S. La sostituzione dell’ aminoacido P347S nella regione C-terminale della proteina RHO ha un ruolo nel corretto traffico dell’ opsina nei fotorecettori. Due vettori effettori portanti due specifici gRNAs e le rispettive Cas9 sono stati generati e testati in vitro e in topi transgenici P347S. Per la parte in vitro, i plasmidi sono stati trasfettati in cloni stabilmente esprimenti il cDNA RHO P347S o wild-type (wt). La frequenza e i tipi di InDels nel sito bersaglio sono stati analizzati mediante il software TIDE, sequenziamento Sanger e NGS. L’analisi in vitro ha dimostrato che la Cas9 ha una maggiore efficienza di taglio nel locus bersaglio rispetto alla variante, senza evidenziare editing sull’allele wt. Le analisi di RT-PCR e Western Blot nelle cellule stabili Hela P347S editate hanno mostrato una forte riduzione dei livelli di mRNA RHO P347S e di espressione della proteina mutata rispetto ai controlli negativi. Per analizzare le conseguenze derivanti dall’editing sul cDNA RHO P347S è stato eseguito uno studio sui mutanti più frequenti generati dal taglio sito-specifico. Sei mutanti RHO sono stati clonati ed analizzati per la loro espressione, localizzazione e stabilità in cellule CHO. L’ immunofluorescenza ha mostrato una localizzazione principalmente a livello della membrana plasmatica. I saggi di Western Blot e cicloesimide hanno mostrato una riduzione delle proteine mutanti caratterizzate da delezioni >9 nt nel sito bersaglio quando comparati con la proteina wt. Al contrario, i mutanti RHO portanti InDels di 1-2 nt non venivano degradati. Questi mutanti, stabilmente espressi in cellule RPE1 TERT-immortalizzate (iRPE1), hanno mostrato un effetto tossico pari alle cellule iRPE1 esprimenti RHO P347S. L’analisi dei mutanti RHO ha dimostrato che la riduzione della proteina è parzialmente legata ad un meccanismo proteasoma-mediato dei mutanti con delezioni >9nt. Tuttavia, la restante parte dei mutanti RHO non degradati ha mostrato una citotossicità comparabile con il mutante P347S. Al fine di trasferire questa strategia in un modello preclinico in vivo vettori AAV2/8 codificanti per la SpCas9wt o per la SpCas9 VQRHF1 insieme a AAV2/8 portanti i corrispettivi gRNA e una cassetta GFP come gene reporter sono stati generati ed iniettati nella retina di topi transgenici portanti la mutazione RHO P347S. Le analisi di TIDE e NGS hanno permesso di valutare gli InDels generati nel gene Rodopsina P347S. Il test di Optical Coherence Tomography (OCT) non ha mostrato miglioramenti della funzionalità retinica negli occhi trattati dei topi transgenici P347S rispetto ai controlli. Il risultato in vivo dimostra che l’efficienza del sistema deve essere ottimizzata e che la combinazione tra il silenziamento del gene mutato e l’introduzione di cDNA wt esogeno può essere una migliore strategia per il trattamento delle adRP.
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Abstract
Rhodopsin (RHO) mutations represent a common cause of blindness, accounting for 25-30% of autosomal dominant Retinitis Pigmentosa (adRP) and 8-10% of all RP. In adRP, a mutation in only one allele is sufficient to cause retinal degeneration. For this reason, developing CRISPR/Cas9 system as genome editing tool to specifically knock-down the defective RHO allele represents a valid gene therapy approach. Cas9-mediated DNA double strand breaks predominantly trigger non-homologous end joining repair that introduces insertions/deletions (InDels) in the target region potentially leading to permanent knock-down. In this study, the efficacy and specificity of S.pyogenes Cas9 (Cas9) and its high-fidelity variant VQR (Cas9-VQR-HF1) to inactivate the RHO P347S mutation was explored. The P347S amino acid substitution in the C-terminus of RHO protein, strongly affects the opsin trafficking to the rod outer segment and represents one of the most common dominant RHO mutations in Europe. Specific gRNAs were properly coupled to Cas9 nucleases generating 2 effector vectors used in vitro and in transgenic P347S mice. For in vitro analysis, HeLa clones stably expressing P347S or wild-type (wt) RHO cDNA were established and transfected with effector plasmids. The frequency and type of InDels were analysed by TIDE software, Sanger sequencing and NGS of PCR amplicons surrounding targeted site. In vitro analyses of RHO editing showed that Cas9 was more efficient than Cas9-VQR-HF1 in introducing InDels in the target locus, with almost undetectable editing of wt RHO. Quantitative RT-PCR and Western Blot analysis on edited P347S HeLa clones demonstrated a strong reduction of RHO P347S mRNA and protein level compared to cells transfected with Cas9 nuclease alone or untreated. To address the possible outcomes resulting from unpredictable editing of RHO P347S cDNA, a comprehensive study on the most frequent RHO mutants generated by editing was performed. Six RHO mutants were cloned and analysed for their expression, localisation and stability in transfected CHO cells. Immunofluorescence analysis showed a predominant localisation of all mutant proteins to the plasma membrane. Western Blot and cycloheximide chase assay showed a strong reduction of RHO mutant proteins carrying deletions >9 nt at the C-terminus encompassing the target site when compared to wt RHO protein. Conversely, RHO mutants carrying mild rearrangements in the target site (1-2 nt. InDels) leading to stop codon formations in the 3’UTR region were not degraded. Cell viability analyses of these mutants, stably expressed in RPE1 TERT-immortalized (iRPE1) clones, showed a toxic effect as observed in iRPE1 clone expressing P347S protein. The analysis of post-editing mutants indicated that the overall reduction of RHO mutant proteins was correlated with proteasome-mediated degradation of mutants bearing deletion >9nt. Whereas, the residual un-edited and not degradated RHO mutant proteins had a cytotoxic effect comparable to P347S protein. To translate this strategy to a preclinical in vivo model, P347S transgenic mice were subretinally co-injected with AAV2/8 vectors coding for Cas9, or Cas9-VQR-HF1, together with AAV2/8 vectors carrying the appropriate or scramble gRNA and a GFP reporter gene. InDels specific for the human P347S gene were detected in the retina treated with the effector viruses compared to the scramble gRNA or GFP by TIDE and NGS analyses. Nuclease-treated eyes did not show outer nuclear layer changes compared to control eyes by optical coherence tomography (OCT). The in vivo data indicate that rod transduction and P347S knockdown efficiencies need to be optimized and possibly a combined gene knockdown and gene addiction therapy is mandatory for gene therapy approach to adRP.
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