• microglia
• nanoparticelle
• nanotossicologia
• neuroni
• tossicità

Diversi studi in vitro hanno indicato la potenziale tossicità di nanoparticelle (NPs) su colture e linee cellulari. Due differenti linee cellulari umane (SH-SY5Y, U87 MG) rispettivamente neuronali e gliali, e una linea cellulare murina (BV2) di microglia, sono state usate come modello per studiare l'interazione di NPs metalliche in vitro. In parallelo, cellule gliali e neuronali corticali primarie di ratto sono state coltivate per simulare la condizione del cervello in vivo. Nanoparticelle di oro (Au), ossido di ferro (Fe3O4), cobalto (Co) e ossido di cerio (CeO2) sono stati acquistate presso Nanostructured & Amorphous Materials Inc. (Houston, USA) in forma di polvere e risospese come definito dalla linea guida OECD WPMN (program for the testing of Manufacture Nanomaterials).
Delle NPs in soluzione si è calcolata la dimensione, la concentrazione e la carica superficiale con tecniche di Microscopia Elettronica a Trasmissione (TEM), Dynamic Light Scattering e potenziale Zeta. La morfologia delle cellule SH-SY5Y, U87 MG e BV2, trattate per 48/72 ore a 37° C con differenti concentrazioni di NPs (150, 15, 1.5, 0.15 microgr x 10^6 cellule), è stata valutata mediante confronto con cellule non trattate utilizzando un microscopio invertito NIKON TMS dotato di una fotocamera digitale (Leica Systems). Per studiare l'interazione di NPs con le cellule e la loro composizione chimica è stato usato un Microscopio Elettronico a Scansione Ambientale (ESEM) (200 ESEM-QUANTA dalla FEI Company, Paesi Bassi) dotato di un sistema di spettrometria a dispersione di energia (EDS da EDAX, USA). Mediante test XTT (XTT viability assay, Invitrogen, USA) e test di incorporazione della BrdU (BrdU cell proliferation ELISA, Roche, Mannheim, Germania) si è valutata la vitalità cellulare e la proliferazione cellulare a 48-72h in seguito ad esposizione alle NPs. Il potenziale effetto cancerogeno delle nanoparticelle è stato misurato utilizzando il saggio two-stage transformation assay: colture di cellule 3T3 sono state analizzate per identificare il potenziale ruolo di iniziatore o promotore delle NPs nella formazione di tumori. Come controllo nel ruolo di iniziatore è stato usato il 3-methylcholanthrene (MCA) mentre il 12-O-tetradecanoylphorbol 13 acetato (TPA) è stato utilizzato come controllo nel ruolo di promotore. Tutti i tipi di NPs sono stati testati alla concentrazione sub-tossica di 1,5 microgr x 10^6 cellule.
I dati di vitalità e proliferazione cellulare ottenuti hanno mostrato risultati diversi a seconda della linea cellulare e della diluizione di NPs. Nel caso della linea neuronale SH-SY5Y, tutte le NPs testate dopo 48 e 72 ore di esposizione hanno mostrato una diminuzione significativa nella vitalità cellulare. La linea cellulare gliale U87 MG ha mostrato una diminuzione della vitalità cellulare dopo trattamento con NPs di ossido di ferro, cobalto e ossido di cerio sia a 48 che a 72 ore. Le SH-SY5Y e U87 MG hanno mostrato un comportamento diverso nell'uptake di NPs dopo 48 ore. Le U87 MG hanno dimostrato una maggiore capacità di internalizzazione rispetto alle SH-SY5Y, indicando la presenza, nelle cellule gliali, di un meccanismo specifico che è in grado di sequestrare le NPs in grande quantità. Nessuna riduzione nella vitalità cellulare dopo esposizione a NPs di oro e di ossido di ferro è stata rilevata nelle cellule primarie di ratto in entrambe le sub popolazioni (cellule gliali e neuroni). Al contrario le cellule BV2 di microglia hanno mostrato un aumento della vitalità cellulare dopo 48h di esposizione a NPs. I dati di cancerogenicità hanno mostrato che le nanoparticelle di oro e di ossido di ferro svolgono un ruolo significativo come promotore. Tuttavia, tutte le NPs testate non hanno mostrato alcun effetto di iniziatore tumorale.

Several in vitro studies have indicated the potential toxicity of nanoparticles (NPs) to various types of neuronal and glial cells. Two human neural culture cell lines, SH-SY5Y and U87 MG, were used as models of neurons and astrocytes respectively while a murine derived BV2 cell line was used as a model of primary microglia. In parallel, primary rat cortical neuronal and glial cells were co-cultured to simulate the in vivo brain condition. gold (Au), iron oxide (Fe3O4), cobalt (Co) and cerium oxide (CeO2) metal NPs were selected and tested. NPs were purchased from Nanostructured & Amorphous Materials Inc. (Houston, USA) in dry powder form and re-suspended in DI water as defined by the OECD WPMN guidance and program for the testing of Manufacture Nanomaterials. NPs suspensions were analyzed to determine size, particle concentration, and surface charge with Transmission Electron Microscopy, Dynamic Light Scattering and Zeta Potential techniques. The morphology of SH-SY5Y, U87 MG, and BV2 cells treated with nanoparticles for 48/72h at 37°C using 150, 15, 1.5, 0.15 microgr x 10^6 cells NPs dilutions, were compared with that of the control untreated cells using a NIKON TMS inverted microscope equipped with a digital camera (Leica systems). Environmental Scanning Electron Microscopy (ESEM) was used in order to study the interaction of the NPs with the cells (ESEM-QUANTA 200 by FEI Company, the Netherlands). To confirm the chemical composition of the NPs, Energy Dispersive Spectroscopy (EDS) analyzes were adopted (EDS by EDAX, USA). Cell viability and cell proliferation was measured after NPs exposure on the two cell lines and on the rat primary cells, using XTT assay and the BrdU cell proliferation ELISA (Roche, Mannheim, Germany). Assessment of nanoparticles potential carcinogenic effect was performed using the two stage cell-transformation assay. 3T3 cell cultures were used as required by the standard method to identify NPs potential initiation or promoting role in tumor formation. As controls a sub-threshold dose of 3-methylcholanthrene (MCA) as the initiator and 12-O-tetradecanoylphorbol 13 acetate (TPA) as the promoter was used. All types of NPs were tested at the sub-toxic dilution of 1.5 microgr x 10^6 cells. Cell viability and proliferation data showed different results based on each cell line and NPs type. In SH-SY5Y cells all the NPs tested showed a decrease of cell viability after 48 and 72 hours of exposure. U87 MG cells showed a decrease in cell viability following treatment with NPs of iron oxide, cobalt and cerium oxide at both 48 and 72h. Interestingly, SH-SY5Y and U87 MG showed a different uptake of NPs after 48h. Indeed U87 MG showed a greater uptake ability compared to SH-SY5Y, indicating the presence, in glial cells, of a specific mechanism which is able to sequestrate the NPs in large amount. Rat primary cells showed no significant decline in cell viability after exposure to gold and iron oxide NPs in both sub population (glial cells and neurons). On the contrary BV2 cells did show an increase in cell viability after 48h of exposure to NPs. Moreover, carcinogenic data showed that gold and iron oxide nanoparticles have a strong promoting effect on 3T3 cell lines. However, all the NPs tested did not show any initiator effect.