Riassunto analitico
La famiglia di proteine TIS11/TTP regola l'espressione genica a livello post-trascrizionale legando in modo specifico sequenze ricche in adenina ed uridina (AREII) contenute nella regione 3' non tradotta (3'UTR) degli RNA messaggeri. Questa famiglia annovera nell'uomo tre membri: ZFP36 (TTP), ZFP36L1 e ZFP36L2. L'effetto del legame di queste proteine agli RNA messaggeri è quello di indurne la degradazione reclutando enzimi de-adenilanti o interferendo con la sintesi della coda di adenine al 3' del messaggero. Il glioma è un tumore primario del sistema nervoso centrale, caratterizzato da alti livelli morbilità e mortalità. Dal punto di vista molecolare, tale neoplasia è sostenuta da mutazioni molto eterogenee tra loro che la rendono resistente all'apoptosi e ne favoriscono l'invasività. Alcuni tra gli oncogeni che contribuiscono a determinare il fenotipo maligno di questo tumore portano sequenze di tipo AREII nella porzione 3'UTR dei loro messaggeri, candidandosi perciò come putativi bersagli della famiglia TIS11/TTP. Tra questi, le chinasi oncogeniche PIM1 e PIM3 ricoprono un ruolo fondamentale nei processi di migrazione che sottendono all'invasività del tumore, mentre la proteina XIAP (X-linked inhibitor of apoptosis) ha un ruolo primario nella protezione delle cellule del glioma dagli stimoli di morte. Basandoci sull'evidenza che ZFP36 è scarsamente espresso nella linea cellulare di glioma ln827 abbiamo valutato le sue potenzialità come oncosoppressore in tale contesto cellulare. Ricostituendone etopicamente l’espressione abbiamo confermato che ZFP36 inibisce il potenziale invasivo e la capacita’ di sopravvivenza. Tale effetto biologico è stato caratterizzato tramite saggi di migrazione cellulare, saggi clonogenici ed analisi dei parametri vitali rilevati con marcature per Annessina V e propidio ioduro. Saggi di luciferasi confermano che le sequenze AREII contenute nel 3' UTR di PIM1, PIM3 e XIAP conferiscono instabilità a tali oncogeni in presenza di ZFP36. Inoltre, il silenziamento genico della loro espressione contribuisce ad attenuare il fenotipo maligno del glioma. Tramite Western Blot abbiamo osservato l'attivazione di programmi di morte cellulare sia di tipo apoptotico che necroptotico. L'insieme di tali evidenze suggerisce che l'azione antitumorale di ZFP36 sia effetto della sua interferenza con molteplici vie di segnalazione cellulare. In ultimo abbiamo dimostrato che è possibile ricapitolare questo effetto terapeutico tramite il trattamento di tali cellule con composti in grado di indurre l'espressione della famiglia genica TIS11/TTP.
|
Abstract
The TIS11/TTP family of mRNA binding proteins regulates gene expression at the post transcriptional level. Three members belonging to this family have been described in humans: ZFP36 (TTP), ZFP36L1 and ZFP36L2. TIS11/TTP proteins specifically recognize and bind adenine-uridine rich (AREII) sequences located in the 3'UTR of target messenger RNAs. Once bound, TIS11/TTPs either recruit de-adenylating enzymes or interfere with the poly-adenylation of the target mRNA, eventually resulting in mRNA degradation. Glioma is a primary brain tumor, characterized by high morbidity and mortality. At the molecular level glioma is highly eterogeneous and characterized by the activation of multiple signaling pathways that sustain resistance to apoptosis and promote survival and invasiveness. Among the players of this tumor are some oncogenes that carry AREII destabilizing sequences in their 3'UTR, such as the oncogenic kinases PIM1 and PIM3 and the x-linked inhibitor of apoptosis XIAP. Recent reports indicate that inhibition of XIAP sensitizes cells to pro-apoptotic therapy in glioma, while by inactivating PIM kinases it is possible to reduce the invasiveness of cancer cell lines. Moreover, we noticed that ZFP36 is scarcely expressed in the glioma cell line ln827, therefore we evaluated its anti tumoral effect by ectopically restoring its expression in this cellular context. Our experiments show that ZFP36 reduces the invasiveness and the viability of glioma cell line ln827. The biological effects of ZFP36 expression have been described by mean of migration assays, anchorage independent growth assays and Annexin V/ Propidium Idodide staining. Luciferase assays confirm that the AREII sequences located in the 3'UTR of PIM1, PIM3 and XIAP confer instability in presence of ZFP36. Moreover, silencing of PIM1, PIM3 and XIAP determines an increase in cell death and a reduction of the invasiveness of ln827. By Western Blot we show the activation of cell death programs involving both apoptosis and necroptosis in cells over-expressing ZFP36. Taken together, our data show that it is possible to impinge on glioma cell lines viability and invasiveness by restoring the expression of ZFP36. In the last part of the thesis we provide evidence that compounds capable of inducing the expression of TIS11/TTP genes determine a comparable biological effect on the same cell contexts.
|
