Riassunto analitico
I neurosteroidi (NS) sono steroidi endogeni derivati dal colesterolo e sintetizzati “de novo” nei neuroni e nelle cellule gliali. Essi sono in grado di alterare l’eccitabilità neuronale mediante effetti genomici esplicati a livello intracellulare ed effetti non genomici tramite interazione con i recettori GABA e NMDA. E’ noto che alterazioni nella trasmissione GABAergica e glutamatergica sono implicate in varie condizioni come ansia, depressione ed epilessia. Il presente lavoro di tesi compilativa è focalizzato sul ruolo svolto da allopregna-nolone (ALLO), deidroepiandrosterone (DHEA) e il coniugato solfato DHEAS nella depressione maggiore, uno dei disturbi mentali più diffusi, e sulle problematiche analitiche legate alla loro analisi in matrici biologiche.
L’effetto antidepressivo di ALLO deriva da un potenziamento della trasmissione GABAergica e di quella noradrenergica, attraverso stimolazione dei recettori GABA-A espressi nei neuroni noradrenergici. Inoltre, ALLO è in grado di simulare l’effetto feed-back negativo dei glucocorticoidi tramite pathway genomica. DHEA e DHEAS esercitano un effetto antidepressivo tramite meccanismi multipli non del tutto chiariti: azione agonista sul recettore sigma 1, azione sulla trasmissione di noradrenalina e serotonina, aumento della sintesi dei recettori NMDA, effetto antiglucocorticoide, riduzione dei livelli plasmatici di cortisolo.
Attualmente le matrici biologiche maggiormente utilizzate per l’analisi dei NS sono siero/plasma e urine; il loro clean up prevede uno step preliminare di precipitazione delle proteine e idrolisi dei glucuronati, rispettivamente, seguito da estrazione L/L o SPE. La matrice di elezione, se disponibile, è il fluido cerebrospinale (CSF), che consente un monitoraggio dei livelli centrali di NS; le difficoltà legate all’analisi del CSF sono la ridotta concentrazione di analiti e l’invasività del prelievo, che può modificare i livelli dei NS influenzati dallo stress, fra cui ALLO. Per quanto riguarda DHEA e DHEAS, i loro livelli sono influenzati da fluttuazioni circadiane, età e sesso; per tale motivo in letteratura sono riportati risultati contrastanti sulle loro concentrazioni in varie matrici nella depressione maggiore.
Riguardo ai metodi analitici, la radio immunoassay (RIA) presenta problemi di specificità legati a potenziali cross-reattività dell’anticorpo verso molecole a struttura simile all’analita target. La tendenza attuale prevede analisi cromatografiche abbinate alla spettrometria di massa per una sicura identificazione degli analiti. Le analisi GC-MS richiedono la preliminare derivatizzazione degli analiti, preceduta da idrolisi dei NS coniugati; tali steps potrebbero causare perdite di analita e formazione di sottoprodotti, oltre a rese diverse nella formazione degli addotti. Dalla disamina della recente letteratura emerge che l’approccio più seguito è l’analisi LC-ESI-MS in modalità MRM (multiple reaction monitoring), preceduta nel caso dei cheto-steroidi da una derivatizzazione preliminare per migliorare la loro ionizzazione. Le analisi LC-MS risentono dell’effetto matrice dovuto a eventuali fosfolipidi residui, che devono quindi essere rimossi mediante fasi SPE dedicate; è inoltre richiesto di effettuare analisi quantitative con la tecnica dello standard interno utilizzando analoghi deuterati degli analiti di interesse.
In conclusione, i recenti studi suggeriscono il ruolo svolto da ALLO e DHEA/DHEAS come potenziali biomarcatori nella diagnosi precoce e nell’approccio terapeutico della depressione. Per tale motivo è essenziale lo sviluppo di strategie analitiche per una accurata e precisa analisi dei livelli di ALLO e DHEA/DHEAS nelle diverse matrici biologiche, superando le difficoltà correlate alle metodologie ad oggi disponibili.
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