Riassunto analitico
Il Morbo di Parkinson (MP) è la seconda malattia neurodegenerativa più diffusa al mondo, caratterizzata dalla morte precoce dei neuroni dopaminergici della Substantia Nigra pars compacta, regione del cervello responsabile del controllo del movimento e della coordinazione.
Nonostante le cause della malattia non siano attualmente note, vari studi hanno mostrato che uno dei fattori responsabili della neurodegenerazione è lo stress ossidativo che si manifesta anche in seguito ad una eccessiva produzione di radicali liberi dell’ossigeno (ROS) e/o a causa della scarsa efficienza dei sistemi antiossidanti.
Ad oggi non è stato ancora individuato un trattamento efficace nel contrastare l’evoluzione del MP e inibire la neurodegenerazione e recentemente, prodotti di origine naturale con proprietà antiossidanti stanno assumendo sempre più rilevanza come terapia complementare.
I polifenoli, importanti metaboliti secondari delle piante, presentano proprietà antiossidanti e antinfiammatorie. Essi potrebbero inibire la formazione di aggregati di alfa-sinucleina (corpi di Lewy) e ridurre lo stress ossidativo.
Tra i frutti ricchi di polifenoli, l’attenzione si è focalizzata su estratti di mirtillo nero: Vaccinium myrtillus L., e di ciliegia dolce “Moretta di Vignola”: Prunus avium L. Essi presentano elevate concentrazioni di antocianine, polifenoli potenzialmente in grado di chelare i metalli ed eliminare i radicali liberi prodotti in quantità anomale in individui affetti da MP.
Nel presente studio, attraverso l’utilizzo di due tecniche – citofluorimetria e fluorimetria su piastra – e di due diversi fluorocromi – CellROX Green Reagent (CGR) e H2DCFDA – è stata valutata la produzione di ROS su linee cellulari di neuroblastoma (SH-SY5Y) e di microglia (BV2) trattate con Rotenone (ROT) – neurotossina di origine vegetale capace di indurre il blocco della catena respiratoria mitocondriale – e/o con estratti di mirtillo nero e di Moretta di Vignola.
Sono stati condotti esperimenti in cui, alle cellule SH-SY5Y, sono stati aggiunti i terreni di coltura condizionati delle cellule microgliali BV2 trattate con estratti e/o ROT per valutarne la possibile influenza nella produzione di radicali liberi.
La produzione di ROS è stata valutata anche in vivo su teste di maschi adulti di Drosophila melanogaster (D.) – modello animale di MP – trattati con ROT e/o estratto di Moretta.
Confrontando le due tecniche, la fluorimetria su piastra ha fornito maggiore riproducibilità e attendibilità, e in particolare, H2DCFDA ha mostrato una buona marcatura a differenza del CGR che, nelle nostre condizioni, non è utilizzabile.
La colorazione non sempre efficace e altre criticità riscontrate con il CGR nella citofluorimetra, potrebbero essere superate utilizzando H2DCFDA.
I risultati ottenuti in vitro suggeriscono un potenziale effetto antiossidante degli estratti, che si mostrano efficaci nel contrastare la produzione di ROS indotta da ROT su entrambi i tipi cellulari. Anche i mezzi condizionati di microglia trattata con Moretta sono in grado di contrastare la produzione di ROS in cellule SH-SY5Y suggerendo una possibile interazione tra le due linee cellulari.
Per il dosaggio dei ROS negli esperimenti con Drosofila, è stata utilizzata l’analisi fluorimetrica con H2DCFDA. I risultati ottenuti suggeriscono un potenziale effetto antiossidante dell’estratto che sembra efficace anche in vivo nell’opporsi alla produzione di ROS indotta da Rotenone.
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Abstract
Parkinson's disease (PD) is the second most common neurodegenerative disease in the world, characterized by the early death of dopaminergic neurons in the Substantia Nigra pars compacta, the brain region responsible for controlling movement and coordination.
Although the causes of the disease are not currently known, various studies have shown that one of the factors responsible for neurodegeneration is oxidative stress, which also occurs following an excessive production of oxygen free radicals (ROS) and/or due to poor efficiency of antioxidant systems.
To date, an effective treatment has not yet been identified in countering the evolution of PD and inhibiting neurodegeneration and recently, products of natural origin with antioxidant properties are becoming important as complementary therapy.
Polyphenols, important secondary metabolites of plants, have antioxidant and anti-inflammatory properties. They could inhibit the formation of alpha-synuclein aggregates (Lewy bodies) and reduce oxidative stress.
Among the fruits rich in polyphenols, attention was focused on extracts of bilberry: Vaccinium myrtillus L., and sweet cherry "Moretta di Vignola": Prunus avium L. They have high concentrations of anthocyanins, polyphenols potentially capable of chelate metals and eliminate free radicals produced in abnormal quantities in individuals with PD.
In the present study, using two techniques - flow cytometry and plate fluorimetry - and two different fluorochromes - CellROX Green Reagent (CGR) and H2DCFDA - ROS production was evaluated on neuroblastoma cell lines (SH-SY5Y) and microglia (BV2) treated with Rotenone (ROT) - neurotoxin of plant origin capable of inducing blockage of the mitochondrial respiratory chain - and / or with extracts of bilberry and Moretta di Vignola.
Experiments were carried out in which conditioned culture medium of BV2 microglial cells treated with extracts and / or ROT were added to SH-SY5Y cells to evaluate their possible influence in the production of free radicals.
ROS production was also evaluated in vivo on adult male heads of Drosophila melanogaster (D.) - animal model of MP - treated with ROT and / or Moretta extract.
Comparing the two techniques, plate fluorimetry provided greater reproducibility and reliability, and H2DCFDA showed good labeling unlike CGR which, under our conditions, is unusable.
The not always effective staining and other criticalities observed with CGR in flow cytometry could be overcome by using H2DCFDA.
The results obtained in vitro suggest a potential antioxidant effect of the extracts, which are shown to be effective in countering the ROT-induced ROS production on both cell types. Even the conditioned medium of microglia treated with Moretta can contrast the production of ROS in SH-SY5Y cells suggesting a possible interaction between the two cell lines.
For the dosage of ROS in the Drosophila experiments, fluorimetric analysis with H2DCFDA was used. The results obtained suggest a potential antioxidant effect of the extract that seems effective even in vivo in opposing the production of ROS induced by Rotenone.
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