Riassunto analitico
Inherited Retinal Degenerations (IRDs) are genetic disorders that lead to the progressive death of photoreceptor cells in the retina and are among the leading causes of blindness in adults. The disease is caused by mutations in over 300 different genes, and despite the availability of innovative therapies such as gene therapy and retinal prostheses, managing IRDs remains a significant challenge. Recently, the use of antioxidants and neurotrophic factors has shown therapeutic potential in reducing cell death. Pigment Epithelium-Derived Factor (PEDF), in particular, has demonstrated the ability to prevent photoreceptor death in models of retinitis pigmentosa. Recent studies have also identified a 17-amino-acid peptide derived from PEDF, H105A, which binds to the PEDF receptor (PEDF-R) and exhibits promising neuroprotective activity. However, the effectiveness of this peptide is limited by its rapid degradation in the vitreous body, necessitating a delivery system that ensures its stability and controlled release.
To improve the delivery of H105A to the retina, hybrid nanoparticles (NPs) have been developed, composed of the biodegradable polymer PLGA (poly(lactic-co-glycolic acid)) and the cationic lipid DOTAP, coated with hyaluronic acid (HA). NPs offer significant advantages in terms of drug stability, protection, and controlled release, improving the selective uptake of the peptide by the retina. This delivery system could reduce the need for repeated injections, enhancing therapeutic efficacy and reducing side effects associated with invasive therapies.
The goal of this thesis project is to characterize and optimize a PLGA-DOTAP hybrid NP system, coated with HA, for targeted delivery of the H105A peptide. The NPs were designed to protect the peptide from degradation in the vitreous body and improve its therapeutic efficacy. The characterization of the NPs was performed using a variety of techniques, including size measurement, surface charge analysis, morphology, and composition. The nanoparticles have an average size of approximately 240 nm and a negative surface charge of -28 mV after coating with HA.
Quantification of the peptide was carried out using High-Performance Liquid Chromatography (HPLC), allowing for the evaluation of the encapsulation efficiency of the peptide in the NPs to be correlated to its biological activity. The quantification of HA, essential for the stability and targeting of the NPs, was performed using an optimized HPLC method, although some interference from other components (such as DOTAP and the surfactant Pluronic F68) made precise quantification difficult in the formulations. In vitro toxicity tests were conducted using differentiated retinal photoreceptor cultures. The results showed that the NPs were not toxic within certain concentrations. However, the use of peptide-loaded NPs showed greater toxicity compared to empty NPs, a phenomenon partially anticipated due to the known inflammatory effects of NP administration. Cellular uptake tests showed that the HA-coated NPs were efficiently uptaken by cells. However, therapeutic efficacy could be compromised by excessive aggregation and uptake of the NPs, which might prevent the activity of the peptide at the photoreceptor membrane.
The results show that peptide-loaded NPs can improve drug stability and distribution, but further optimization is necessary to reduce toxicity and improve therapeutic efficacy. The next stages of the project involve in vivo studies to confirm the effectiveness and safety of the delivery system and to optimize the formulation for the treatment of degenerative retinal diseases.
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Abstract
Le degenerazioni retiniche ereditarie (IRD) sono patologie genetiche che causano la morte progressiva dei fotorecettori nella retina e sono tra le principali cause di cecità tra gli adulti. La malattia è causata da mutazioni in oltre 300 geni diversi e, nonostante la disponibilità di terapie innovative come la terapia genica e l'uso di protesi retiniche, la gestione dell'IRD rimane una sfida significativa. Recentemente, l'uso di antiossidanti e fattori neurotrofici ha mostrato un potenziale terapeutico per ridurre la morte cellulare. Il Pigment Epithelium-Derived Factor (PEDF), in particolare, ha dimostrato di prevenire la morte dei fotorecettori nei modelli di retinite pigmentosa. Recenti ricerche hanno anche identificato un peptide di 17 aminoacidi derivato dal PEDF, “H105A”, che si lega al recettore PEDF-R e possiede un'attività neuroprotettiva promettente. Tuttavia, l'efficacia di questo peptide è limitata dalla sua rapida degradazione nell'umor vitreo, rendendo necessaria una modalità di somministrazione che ne promuova la stabilità e il rilascio controllato. Per migliorare la veicolazione del peptide H105A alla retina, sono stati sviluppate nanoparticelle (NPs) ibride, costituite da un polimero biodegradabile, PLGA (acido polilattico-co-glicolico), e un lipide cationico, DOTAP, rivestite con acido ialuronico (HA). Le NPs offrono vantaggi significativi in termini di stabilità, protezione del farmaco e rilascio controllato, migliorando l'assorbimento selettivo del peptide da parte della retina. Questo sistema di somministrazione potrebbe ridurre la necessità di iniezioni ripetute, aumentando l'efficacia terapeutica e riducendo gli effetti collaterali associati alle terapie invasive.
Il progetto di questa tesi si concentra sulla caratterizzazione e ottimizzazione di un sistema di NPs ibride PLGA-DOTAP rivestite con HA per il rilascio mirato del peptide H105A. Le NPs sono state progettate per proteggere il peptide dalla degradazione nell'umor vitreo e migliorare la sua efficacia terapeutica. La caratterizzazione delle NPs è stata effettuata utilizzando una serie di tecniche, tra cui la misura delle dimensioni, la carica superficiale, la morfologia e la composizione. Le nanoparticelle hanno una dimensione media di circa 240 nm e una carica superficiale negativa di -28 mV dopo il rivestimento con HA.
La quantificazione del peptide è stata effettuata utilizzando la Cromatografia Liquida ad Alta Prestazione (HPLC), permettendo di valutare l'efficienza di incapsulazione del peptide nelle NPs per poterla correlare all’attività biologica esercitata. La quantificazione dell'HA, essenziale per la stabilità e il targeting delle NPs, è stata effettuata con un metodo HPLC ottimizzato, sebbene alcuni problemi di interferenza da parte di altri componenti (come il DOTAP e il surfattante Pluronic F68) abbiano reso difficoltosa una quantificazione precisa nelle formulazioni. I test di tossicità in vitro sono stati condotti utilizzando colture di fotorecettori retinici differenziati. I risultati hanno mostrato che le NPs non risultano tossiche entro determinate concentrazioni. Tuttavia, l'uso delle NPs caricate con il peptide ha mostrato un effetto tossico maggiore rispetto alle NPs vuote, un fenomeno parzialmente previsto in quanto la somministrazione di NPs può indurre infiammazione. I test di uptake cellulare hanno evidenziato che le NPs rivestite con HA vengono internalizzate dalle cellule in modo efficiente. Tuttavia, l'efficacia terapeutica potrebbe essere compromessa dall'aggregazione e dall'uptake eccessivo delle NPs, che potrebbe impedire l'attivazione del peptide a livello dei fotorecettori.
I risultati mostrano che le NPs caricate con il peptide H105A possono migliorare la stabilità e la distribuzione del farmaco, ma sono necessarie ulteriori ottimizzazioni per ridurre la tossicità e migliorare l'efficacia terapeutica.
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