Riassunto analitico
Temperature al di sotto dello zero rappresentano una delle maggiori limitazioni per il potenziale produttivo dell’orzo (Hordeum vulgare L.). La tolleranza a tali temperature dipende da un processo fisiologico noto come acclimatamento. Quest’ultimo è principalmente mediato da fattori di trascrizioni chiamati C-repeat binding factors (CBF) in grado di modulare l’espressione di multipli geni effettori che a loro volta provvedono a ripristinare la fisiologica omeostasi cellulare. Studi genetici condotti in orzo hanno dimostrato che gran parte della variazione fenotipica osservata nella tolleranza alle basse temperature è spiegata da due QTL (Quantitative Trait Loci), Fr-H1 and Fr-H2, localizzati sul braccio lungo del cromosoma 5H. Fr-H1 coincide con il locus Vrn-H1 implicato nella richiesta di vernalizzazione, mentre Fr-H2 segrega con un cluster di più di 13 geni codificanti per HvCBF. Diversi studi sono stati condotti per investigare il meccanismo di azione di tali QTL. Recentemente è stato dimostrato che l’acquisizione della tolleranza al freddo potrebbe essere legata a una specifica tipologia di variazione strutturale nota come Copy Number Variation (CNV), definita come un cambiamento sbilanciato nella struttura del genoma che include inserzioni, delezioni e duplicazioni. In particolare, lo studio ha rivelato che genotipi con un maggior numero di copie di HvCBF4 e HvCBF2 mostravano un aumento nella tolleranza al freddo. Al contrario, un ruolo negativo è stato trovato per il HvCBF3. La presente tesi di dottorato ha come obiettivo principale quello di fare ulteriore luce sui meccanismi genetici e molecolari coinvolti nella tolleranza al freddo in orzo. In particolare, nella prima parte del lavoro è stata ricostruita la sequenza del locus Fr-H2 nella cultivar invernale resistente al freddo ‘Nure’. La sequenza, ottenuta mediante tecnologia PacBio, è stata sottoposta a dettagliata annotazione strutturale e funzionale e curata manualmente. I risultati sono poi stati confrontati con il corrispondente locus del genotipo di riferimento ‘Morex’, primaverile e suscettibile al freddo. La comparazione strutturale ha rivelato interessanti variazioni strutturali come ad esempio il CNV per il segmento HvCBF4-HvCBF2 nella parte prossimale del cluster di CBF e due inversioni nella parte centro-distale del locus. Ulteriori differenze hanno riguardato la composizione genica e degli elementi ripetuti. Nella seconda parte del lavoro è seguita la validazione funzionale tramite qRT-PCR di alcuni geni nel cluster di HvCBF: HvCBF4, HvCBF2 e HvCBF14. L’espressione è stata analizzata per due cultivar contrapposte per la loro capacità di tolleranza al freddo, ‘Tremois’- suscettibile e con 2 copie del segmento HvCBF4-HvCBF2 e ‘Pamina’- resistente e con 12 copie stimate del segmento HvCBF4-HvCBF2, dopo esposizione a 6°C per 2 e 10 ore. Risultati preliminari dimostrano che l’esposizione al freddo determina un cambiamento nell’espressione genica, soprattutto per quanto riguarda il HvCBF14, mentre è possibile ipotizzare differenze nel livello basale di espressione di HvCBF4 in ‘Pamina’ rispetto a ‘Tremois’. Nell’ultima sezione dell’elaborato viene riportato lo sviluppo di nuovo materiale genetico, le linee QTL-NIL (QTL-Near Isogenic Lines), in grado di permettere l’isolamento dell’effetto di ciascun QTL e dei HvCBF. Tramite la separazione dell’effetto dei QTL e dei HvCBF, potrebbe essere possibile chiarire il contributo di ciascun QTL e HvCBF, un eventuale effetto combinato o meccanismi indipendenti dai HvCBF. I risultati ottenuti rappresentano importanti progressi nell’ambito della comprensione delle basi genetiche del fenotipo di resistenza al freddo in orzo.
|
Abstract
Freezing temperatures represent one of the major limitations to barley yield potential. Freezing tolerance (FT) depends on a period of cold acclimation mediated by C-repeat binding factors (CBFs), transcriptional regulators that modulate the expression of multiple effector genes that, in turn, act to restablish the cellular homeostasis. Genetic studies have demonstrated that in barley a large part of the observed phenotypic variation in FT is explained by two QTLs, Fr-H1 and Fr-H2 on the long arm of chromosome 5H. Fr-H1 coincides with Vrn-H1 locus involved in barley vernalization requirement, while Fr-H2 segregates with a cluster of more than 13 barley CBFs. Several studies have been carried out to investigate the mechanisms of action at the basis of FT. Recently, it has been demonstrated that the acquisition of FT may be due to a specific structural variation (SV) called Copy Number Variation (CNV), defined as unbalanced changes in the genome structure and include insertions, deletions and duplications. Particularly, it was reported that genotypes with an increase copy number of HvCBF4 and HvCBF2 showed greater FT. A negative role of HvCBF3 was also suggested. The major aim of the present thesis was to gain more insights into the molecular and genetic basis of FT in barley. Particularly, in the first part of the work the reconstruction of ‘Nure’ (winter habit, frost resistant genotype) Fr-H2 locus was described. The sequencing of Fr-H2 was obtained by PacBio sequencing technology and the final sequence was structurally and functionally annotated and manually curated. The results of sequencing for ‘Nure’ were thus compared with the corresponding locus in ‘Morex’, the reference genome (spring habit, frost susceptible genotype). Structural comparison revealed interesting SVs including copy number variation (CNV) for HvCBF4-HvCBF2 genomic region in the proximal part of the CBF cluster and several inversions in the central-distal part of the locus. Additional differences were also found in terms of genes and repetitive element composition. In the second part of the work the functional validation of selected members of CBF cluster (HvCBF4, HvCBF2 e HvCBF14) was performed by qRT-PCR. Expression analysis was carried out in two contrasting cultivars (‘Tremois’- frost susceptible with 2 copies of HvCBF4-HvCBF2 genomic region and ‘Pamina’- frost resistant with 12 estimated copies of HvCBF4-HvCBF2 genomic region) after exposure to 6°C for 2 and 10 hours. Preliminary results showed that the exposure to low temperature caused a change in gene expression, especially for HvCBF14; while a differential basal level of expression of HvCBF4 could be hypothesized in ‘Pamina’ respect to ‘Tremois’. In the last part of the thesis, the development of new genetic material, the QTL-NILs, is described. Such new genetic material will be useful in the isolation of the effect of each QTL and HvCBFs. By separating the effects of the single QTL and HvCBF, it might be possible to better clarify the contribute of each QTL and HvCBF, investigate a possible combined effect or eventually identify an effect of other sequences independent from the CBFs.
These results represent a significant step forward in the understanding of the genetic basis of the frost tolerant phenotype in barley crop.
|