• Hinokitiolo
• Liposomi
• Nanomedicina
• NP lipidiche
• PLGA

L’emocromatosi è una malattia autosomica recessiva caratterizzata da una disregolazione dell’omeostasi del ferro, che porta alla formazione di accumuli di ferro in articolazioni, cuore e fegato, causando carcinoma epatocellulare, cardiomiopatia ed infiammazione cronica. Il miglior trattamento disponibile è la flebotomia, mentre i farmaci attualmente disponibili presentano effetti collaterali imprevedibili e debilitanti. L’hinokitiolo (HK) è un nuovo chelante del ferro che mostra risultati molto promettenti, con efficacia gradiente-dipendente e un buon profilo di sicurezza. Il suo uso è però limitato dalla scarsa solubilità e dalla bassa specificità di distribuzione. L’impiego di nanoparticelle (NPs) potrebbe superare queste limitazioni, aumentandone la solubilità e aprendo alla possibilità di direzionarla su target specifici.
In questo lavoro, varie NPs biocompatibili e biodegradabili sono state vagliate per la migliore incapsulazione dell’HK per somministrazione parenterale. Sono state valutate NPs di PLGA (poli lattico-co-glicolico), liposomi neutri e cationici, e NPs di colesterolo, tutte a partire da protocolli precedentemente ottimizzati nel laboratorio TeFarTi, aggiungendo il 10-25% in peso di HK. Tutte le formulazioni hanno mostrato una dimensione < 300 nm e ottima omogeneità (PDI < 0.3), in linea con i risultati precedenti. Per purificare le NPs sono stati testati diversi metodi, ma la dialisi si è dimostrata il metodo più efficace per eliminare il farmaco non incapsulato senza peggiorare le caratteristiche chimico-fisiche dei vettori. L’efficienza di incapsulazione (EE%) è risultata bassa (< 10%) in tutti i campioni, ad eccezione delle particelle di colesterolo, che invece presentavano una EE del 23%. Durante gli esperimenti infatti è stato notato che HK è molto volatile, e veniva perso durante diversi step formulativi: evaporazione del solvente, liofilizzazione, estrazione con solvente. Ogni protocollo è stato quindi riadattato utilizzando recipienti ermetici e limitando il tempo di contatto con solventi organici. In parallelo sono state prodotte particelle lipidiche nanostrutturate (NLCs) di acido stearico e glycerol mono-oleato, il cui protocollo di formulazione non prevede l’uso di solventi organici. Le NLC sono risultate omogenee (PDI < 0.2) di dimensioni di ~140 nm, stabili in dimensione anche dopo congelamento e scongelamento. Per quantificare il farmaco incapsulato senza l’uso di solventi, è stato ottimizzato un metodo di analisi in HPLC in temperatura. In particolare il campione purificato è stato diluito con acetonitrile in contenitore ermetico e poi portato a 80°C per solubilizzare completamente le NLC e liberare il farmaco, questa soluzione è stata poi iniettata in HPLC mantenendo la colonna a 78°C. L’analisi ha dimostrato un'efficienza di incapsulazione per le NLC del 25%, probabilmente più vicino al valore reale e non sottostimato a causa della volatilità della molecola.
Questo studio ha valutato diversi sistemi per la veicolazione di un nuovo farmaco per l’emocromatosi, con grandi limitazioni legate alle caratteristiche chimico-fisiche della molecola. Le strategie attuate hanno portato a un dato positivo di incapsulazione del farmaco del 25% per sistemi NLC, e del 23% per NPs di colesterolo, sebbene quest’ultimo possa risultare ancora sottostimato rispetto al valore reale di incapsulazione. In studi futuri sarà necessario adattare ulteriormente i protocolli di formulazione per ridurre la perdita di HK, inoltre sono in progetto dei test per quantificare il farmaco incapsulato nelle varie formulazioni mettendolo in proporzione con la sua attività in vitro in modelli di emocromatosi.

Hemochromatosis is a hereditary autosomal recessive disorder, characterized by a dysregulation in iron metabolism and homeostasis which leads to the formation of iron deposits in joints, heart, and liver ultimately causing hepatocellular carcinoma, cardiomyopathy, and chronic joint inflammation. Currently, the gold standard of treatment available is represented by phlebotomy, while oral iron chelators available on the market show unpredictable and undesirable collateral effects. Hinokitiol (HK) is a novel small molecule iron chelator that has shown promising results, exhibiting gradient-dependent efficacy and positive safety profile. However, it’s not exempt from drawbacks, such as poor water solubility and poor tissue specificity make the administration of HK very challenging. In this view, the use of nanomedicines could help overcome these limitations. In this work various nanocarriers were screened for improved efficient HK encapsulation, as a basis for future studies aiming at achieving higher selectivity, and exploiting their surface decoration to promote drug accumulation in a specific site. Biocompatible and biodegradable nanoparticles (NPs) were evaluated, i.e. polymeric PLGA (poly lactic co-glycolic acid) NPs, liposomes (neutral and cationic), and cholesterol NPs were prepared using procedures already optimized by the TeFarTi lab with 5 mg, 10 mg, or 15 mg (10% - 25% w/w) of HK being added. Each formulation demonstrated a size of < 300 nm and optimal homogeneity (PDI < 0.3), all in line with previous results. To purify the formulations and remove the free HK various methods were tested, and among all dialysis was better capable of removing the free drug while maintaining the chemical-physical characteristics of the nanocarriers. For each type of nanodelivery system, the encapsulation efficiency (EE%) was underwhelming at less than 10% with the exception of Cholesterol NPs which showed a max EE% of 23%. This low EE% could be attributed to an observed characteristic of the HK, its volatility, which would cause unnecessary losses at several key points of the formulation processes used: solvent evaporation, lyophilization, and the extraction with solvents for quantification with the HPLC. To try to improve on this, every possible formulative step was readapted to limit these losses without success including, other UV-VIS and colorimetric quantification methods without avail due to too low concentrations. To confront this issue from another angle, nanostructured lipid carriers (NLCs) constituted of stearic acid and glycerol mono-oleate were tested. Due to the core materials characteristic melting points, and the compatible melting point of HK, can be formulated by hot homogenization and quantified by HPLC at elevated temperatures (78°C) without the use of organic solvents. This approach led to the formulation of homogeneous NPs (PDI < 0.2) with size of ~ 140 nm, which were dimensionally stable even after freezing and thawing. NLCs showed EE% of 25%, probably closer to its real value of encapsulation, and not underestimated due to the molecule volatility. This study evaluated various delivery systems for a new drug for hemochromatosis, with significant limitations related to the chemical-physical characteristics of the molecule. The implemented strategies resulted in a positive EE% of 25% for NLC systems and 23% for cholesterol NPs, although may still be underestimated compared to the actual encapsulation value. In future studies, it will be necessary to further adapt formulation protocols to reduce the loss of the drug. Additionally, tests are planned to quantify the encapsulated drug in various formulations, correlating it with its in vitro activity in hemochromatosis models.