• chromosome 9
• duplication
• JAK2
• myelofibrosis
• PD-L1

Le neoplasie mieloproliferative Philadelphia-negative (MPNs), che includono Mielofibrosi Primaria (PMF), Policitemia Vera (PV) e Trombocitemia Essenziale (ET), sono neoplasie ematologiche caratterizzate dall’espansione clonale di cellule staminali e progenitori emopoietici, e conseguente comparsa di un fenotipo mieloproliferativo. L’insorgenza e le manifestazioni cliniche delle MPNs sono dovute alla presenza di mutazioni driver nei geni JAK2, CALR e MPL, oltre a mutazioni somatiche in molti altri geni coinvolti in rimodellamento della cromatina, regolazione dello splicing e riparo del DNA. Le MPNs possono anche presentare diverse alterazioni citogenetiche con un importante significato prognostico: tra queste, le anomalie del cromosoma 9p sono molto comuni; nonostante ciò, è necessaria una maggiore caratterizzazione degli effetti esercitati dalle alterazioni del cromosoma 9p sul fenotipo cellulare nelle MPNs. Entrambi i geni JAK2 e PD-L1 sono, inoltre, localizzati nella regione cromosomica 9p24.1 ed è noto che l’espressione di PD-L1 sia indotta dall’attività di JAK2. In letteratura, tuttavia, sono riportate poche evidenze riguardo ad una potenziale azione combinata di mutazioni di JAK2 e alterazioni del numero di copie del cromosoma 9p sull’espressione di PD-L1 e sull’esaurimento funzionale delle cellule T.
Abbiamo quindi caratterizzato diversi tipi cellulari isolati da pazienti affetti da mielofibrosi primaria o secondaria, confrontando pazienti con mutazione di JAK2, stratificati in base alla frequenza della variante mutata, rispetto a quelli recanti sia la duplicazione del cromosoma 9p che la mutazione di JAK2.
Per comprendere se la duplicazione del cromosoma 9p e la mutazione di JAK2 interessino lo stesso allele abbiamo eseguito un’analisi, mediante Droplet Digital PCR, del DNA estratto da colonie derivate da cellule CD34+ isolate da questi pazienti. Nella maggior parte delle colonie analizzate l’allele JAK2 mutato è risultato anche duplicato, suggerendo che la maggioranza delle cellule CD34+ in questi pazienti porti due copie dell’allele mutato e una copia dell’allele wild-type.
Inoltre, l’espressione di PD-L1 nei monociti, sia a livello trascrizionale che a livello proteico, è risultata aumentata nei pazienti con la duplicazione del cromosoma 9p rispetto a quelli senza l’alterazione citogenetica. In particolare, PD-L1 è espresso soprattutto a livello della membrana cellulare nei pazienti recanti la duplicazione, mentre risulta localizzato a livello intracellulare nei pazienti diploidi.
Analizzando la capacità clonogenica e differenziativa delle cellule CD34+, mediante saggi clonogenici in metilcellulosa e saggi clonogenici megacariocitari, è emerso che i pazienti con mielofibrosi recanti la duplicazione del cromosoma 9p presentano una maggiore capacità clonogenica e un minore potenziale differenziativo rispetto ai pazienti diploidi.

Questi risultati sono coerenti con l’incremento della frazione di cellule T circolanti esauste riscontrato nei pazienti con la duplicazione del cromosoma 9p, rispetto a quelli diploidi.
Complessivamente questi risultati suggeriscono un effetto combinato di mutazioni di JAK2 e duplicazione del cromosoma 9p nell’incremento dell’espressione di PD-L1 e nella sua localizzazione cellulare, nell’esaurimento funzionale delle cellule T e nella capacità clonogenica e differenziativa in pazienti affetti da mielofibrosi.

Philadelphia-negative myeloproliferative neoplasms (MPNs) are hematological malignancies including Primary Myelofibrosis (PMF), Polycythemia Vera (PV) and Essential Thrombocythemia (ET), characterized by clonal expansion of hematopoietic stem and progenitor cells, leading to a myeloproliferative phenotype. MPNs onset and clinical manifestations are due to driver mutations in JAK2, CALR or MPL genes, as well as many other acquired somatic mutations in genes involved in chromatin remodelling, alternative splicing and DNA repair. MPNs can also display many cytogenetic alterations with an important prognostic value: among these, the abnormalities of chromosome 9p are very common. A further characterization of the effects exerted on the cellular phenotype by chromosome 9p alterations in MPNs is needed. Moreover, JAK2 and PD-L1 genes are both encoded on 9p24.1, and the expression of the latter is upregulated by JAK2 activity. Little is known about a potential combined action of JAK2 mutations and 9p copy number variations on PD-L1 expression and on T cell functional exhaustion. Therefore, we characterized different cell types isolated from patients affected by either primary or secondary myelofibrosis, comparing JAK2-mutated patients, stratified according to JAK2 Variant Allele Frequency (VAF), with those carrying both 9p duplication and JAK2 mutation . To investigate whether 9p duplication and JAK2 mutation affect the same allele, we set up a Droplet Digital PCR analysis of DNA extracted from CD34+-derived colonies of patients carrying 9p duplication. In the majority of the analysed colonies the JAK2 mutated allele was also duplicated, suggesting that most of the CD34+ cells in these patients carry two copies of the mutant allele and one copy of the wild-type allele. Moreover, PD-L1 expression in monocytes, both at transcriptional level and protein level was increased in patients with chromosome 9p duplication compared to those without the cytogenetic alteration. Additionally, PD-L1 was mostly expressed on the cell membrane in patients carrying 9p duplication, while it was localized at the intracellular level in diploid patients. By investigating the clonogenic and differentiative capacity of CD34+ cells through Colony-Forming Unit (CFU) assays and megakaryocytes clonogenic assay, we observed that MF patients with 9p duplication display a higher clonogenic and stemness capacity, compared to diploid patients. These results were consistent with the increased fraction of circulating exhausted T cells in patients carrying chromosome 9p duplication, when compared to diploid patients. Comprehensively, these results suggest a combined effect of chromosome 9p duplication and JAK2 mutations in affecting PD-L1 expression and its cellular localization, T cell exhaustion as well as the clonogenic activity and lineage commitment in patients with myelofibrosis.