Riassunto analitico
I tumori ovarici epiteliali (EOC), come il carcinoma ovarico sieroso di alto grado (HGSOC), rappresentano circa il 90% di tutti i casi di OC. Alcuni sintomi diagnostici sono stati convalidati, ma diventano chiaramente visibili solo in fasi avanzate di crescita del tumore. Secondo l'OMS, ogni anno verranno diagnosticati 225.550 casi di OC, che rappresenta globalmente l'ottava causa di morte per cancro nelle donne. Nonostante i vari studi di identificazione di nuovi biomarcatori per la diagnosi di OC (i.e. proteina CA125), nessuno di essi è stato ancora validato. Finora, le terapie standard consistono in una riduzione chirurgica del tumore seguita da chemioterapia e/o radioterapia. Tuttavia, questi farmaci tendono a sviluppare farmaco-resistenza dopo diversi cicli di somministrazione e provocano gravi effetti collaterali. È quindi necessario identificare nuovi biomarcatori per effettuare una diagnosi precoce e guidare il processo di Drug Discovery. L'Istituto Nazionale dei Tumori di Milano (INT) ha fornito al Drug Discovery and Biotechnology Laboratory (UniMoRe) 44 campioni di ascite, raccolti dal 2015 al 2018 da pazienti al III/IV stadio di HGSOC, in trattamento con composti del platino.
Lo scopo di questa collaborazione è quello di identificare nuovi biomarcatori attraverso la proteomica LC-MS/MS e di studiare nuovi composti chimici in grado di bersagliarli. La sezione sperimentale di questa tesi è divisa in due parti principali:
A. La prima comprende il trattamento di campioni di ascite e i risultati preliminari dell'analisi MS per indagare le proteine differenzialmente espresse (DEP);
B. La seconda comprende la valutazione delle proteine più significative con l'obiettivo di identificare nuovi bersagli e molecole putative del OC.
Tutti i campioni sono stati sottoposti a un trattamento MS-proteomico label-free, che comprendeva una fase di immunodeplezione delle proteine più abbondanti, una tecnica di Filter-Aided-Sample-Preparation (FASP), un C-18-Desalting preliminare e l'analisi LC-MS/MS su una MS ad alta risoluzione (HRMS, Orbitrap Exploris 480, Thermo Fisher).
Dopo un'analisi Unsupervised del proteoma dell'intero campione, il nostro progetto metterà a confronto diversi gruppi di secondo i seguenti criteri:
i. Resistenza vs Sensibilità al trattamento;
ii. Progressione tumorale vs Remissione tumorale;
iii. Differenziazione dei campioni dai risultati dell'analisi Unsupervised: valori di PC1 positivi vs valori di PC1 negativi.
Lo studio è stato diretto alla valutazione delle DEPs, identificate dopo un'analisi statistica eseguita con Proteome Discoverer (Thermo Fisher).
Rappresentano le proteine significativamente (p<0,05) up o down regolate rispetto ai controlli, con un rapporto tra la concentrazione del campione considerato e quella del campione di riferimento (arbitrario =1, > 2 (up) o <0,5 (down). Il log(base2) di questo rapporto è denominato "Fold-Change" (FC) ed esprime la concentrazione logaritmica di una proteina nel campione considerato, quando il campione di controllo è assegnato a "0".
Le nostre DEPs sono state analizzate con diversi strumenti bioinformatici, per identificare i Biological Processes e i Cellular Components in cui sono principalmente coinvolte. Il recettore alfa dei folati (FOLR1, FC = 5,98) e la caderina 11 (CDH11, FC = 1,66) sono stati up-regolati nei campioni resistenti, mentre la metalloproteasi 9 della matrice (MMP9, FC = 2,31) è stata up-regolata nei campioni in progressione tumorale.
La seconda fase di questa tesi comprende la valutazione dei metadati delle proteine precedentemente identificate per valutare nuovi composti farmacologici, attualmente in fase di sperimentazione clinica, per suggerirne un potenziale sfruttamento in terapia del OC.
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Abstract
Epithelial Ovarian Cancers (EOC), like High Grade Serous Ovarian Carcinoma (HGSOC), represent about 90% of all OC cases. Some diagnosing symptoms has been validated, but they become clearly visible only at advanced stages of tumor growth. According to the WHO each year 225,550 of OC, which represents the 8th leading cause of cancer-related death among women worldwide, will be diagnosed. Despite many studies are ongoing to identify new biomarkers for OC diagnosis (like CA125 protein) none of them has been validated yet. So far, OC standard therapies consist in cytoreductive tumor surgery followed by chemotherapy and/or radiotherapy. However, these drugs are likely to develop Drug Resistance (DR) after several cycles of administration and are responsible for a wide types of severe side effects. It is then necessary to identify new OC biomarkers capable of early-stage diagnosis and able to drive the Drug Discovery process. Istituto Nazionale dei Tumori di Milano (INT) provided 44 samples of ascites, collected from 2015 to 2018 from III/IV stage HGSOC patients in treatment with platinum-based compounds, to the Drug Discovery and Biotechnology Laboratory (UniMoRe).
The aim of this collaboration is to identify new OC biomarkers through LC-MS/MS Proteomics, which is one of the most direct and preliminary method among the various approaches, and to investigate new chemical compounds able to target them. The experimental section of this thesis is divided into two main parts:
A. The first one encompasses the sample treatment of the ascites and the preliminary results from MS analysis to investigate the Differentially Expressed Proteins (DEPs);
B. The second one includes the Medicinal Chemistry evaluation of the most significant proteins with the aim to identify new putative OC targets and molecules.
All the samples underwent a label free MS proteomics processing, including highest abundant protein immunodepletion step, filter aided sample preparation (FASP) technique, a preliminary C-18 desalting, and the proper LC-MS/MS analysis on a High-Resolution Mass Spectrometry (HRMS, Orbitrap Exploris 480, Thermo Fisher).
After an unsupervised analysis of the whole samples’ proteome, our project will confront different groups of data classified according to the following criteria:
i. Resistant to Pt-based treatment vs Sensitive to Pt-based treatment samples;
ii. Cancer progression vs Cancer remission samples;
iii. Analysis of sample differentiation from the results of the unsupervised analysis: positive vs negative PC1 values samples.
The study was directed on the evaluation of DEPs, identified after a statistical analysis performed with Proteome Discoverer suite (Thermo Fisher). They represent the proteins which are significantly (p<0.05) up or down regulated with respect to controls, with a ratio between the considered sample concentration and the reference sample (arbitrary =1) concentration of > 2 (up) or <0.5 (down). The log(base2) of this ratio is referred as ‘Fold-Change’ (FC) and expresses the logarithmic concentration of one protein in the considered sample, when the control sample is assigned to ‘0’.
Our DEPs were investigated with different bioinformatic tools, to identify the Biochemical Pathways and Cellular Components in which they are mainly involved. Folate Receptor alpha (FOLR1, FC = 5,98) and Cadherin 11 (CDH11, FC = 1,66) were up-regulated in Resistant samples while Matrix Metalloproteinase 9 (MMP9, FC = 2,31) was up-regulated in Cancer Progression samples.
The second step of this thesis include the metadata evaluation of the previously identified proteins to evaluate new drug compounds, currently processed in clinical trials, to suggest a potential exploitation in OC therapy.
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