Riassunto analitico
L’enzima timidilato sintasi è un omodimero obbligato di circa 76 kDa. I due monomeri che costituiscono il dimero sono disposti in modo antiparallelo l’uno rispetto all’altro e il sito attivo della forma dimerica è individuato da residui di entrambi i monomeri. hTS è fondamentale nella biosintesi del DNA. La sua funzione infatti è quella di catalizzare la conversione del dUMP a dTMP tramite una metilazione riduttiva che utilizza il 5,10 metilentetraidrofolato come coenzima, il quale viene convertito a diidrofolato.
Diversi studi hanno messo in evidenza il suo ruolo in patologie come il tumore al colonretto (CRC) in cui è stata osservata una sovraespressione dell’enzima. Per tale ragione, l’enzima è diventato un target validato nella terapia antitumorale. I farmaci di elezione in queste terapie sono rappresentati dalla classe degli antimetaboliti mimetici del dUMP come il 5-fluorouracile (5-FU), e del coenzima tra cui metotrexato, e raltitrexed. Sfortunatamente, l’uso prolungato di questi farmaci porta all’insorgenza di fenomeni di farmaco resistenza.
Nel corso degli anni, sono stati molti gli studi atti ad individuare nuovi agenti chemioterapici attivi contro hTS privi però degli effetti collaterali dei farmaci “classici”. Studi su hTS hanno inoltre evidenziato come all’interno del nucleo, l’enzima si trovi in equilibrio tra la sua forma dimerica (attiva) e la sua forma monomerica (inattiva).
Recentemente, studi condotti su questo enzima hanno fatto emergere una nuova e promettente classe di inibitori della proteina con un meccanismo di azione innovativo. Per contrastare i fenomeni di farmaco resistenza, è stato preso in esame l’equilibrio tra dimero e monomero e si è cercato di sviluppare nuovi inibitori capaci di favorirne lo squilibrio verso la forma monomerica Questa nuova classe di inibitori prende il nome di Inibitori dissociativi (Ddis). Questi, sono in grado di legarsi all’interfaccia tra i due monomeri della proteina e perturbano l’equilibrio portando alla dissociazione del dimero in monomeri. Attraverso questa scissione del dimero si esplica la funzione antitumorale dei Ddis che in modo indiretto interferiscono anche con la trascrizione di nuova proteina.
Nel corso degli anni, sono stati sviluppate diverse generazioni di questa nuova classe di Ddis. Attraverso criteri derivanti da dati cinetici, termodinamici, di simulazione molecolare e ottenuti in vitro su linee cellulari, sono state selezionate le due molecole più promettenti. Per le loro proprietà chimiche e biologiche, esse sono utilizzate come Lead compound per lo sviluppo di nuovi inibitori ancora più attivi nei confronti dell’enzima: AIC-A016 e LC1343
Il problema maggiore degli inibitori selezionati è rappresentato dalla loro solubilità. Scopo di questo lavoro è stato la progettazione, la sintesi, la purificazione e l’analisi di nuovi composti modificati al fine di ottenere composti più solubili e più attivi dei lead selezionati. Per la progettazione di questi nuovi composti, si è partiti dall’analisi in silico dei leads selezionati. Utilizzando la suite Maestro di Schoedinger, sono state eseguite delle simulazioni di Induced Fit Docking (IFD) prima dei leads per individuare gli scores di riferimento e successivamente, delle molecole disegnate., Le molecole con gli scores migliori sono state selezionate ed è stata sviluppata una via sintetica per la loro produzione. Queste sono state poi purificate sia attraverso metodi di cristallizzazione sia utilizzando Flash cromatografia, in modo da ottenere livelli di purezza >95% per test cinetici e > 99% per test in vitro, necessari per il proseguimento dello studio sui sistemi biologici.
Per determinare l’attività inibitoria dei nuovi Ddis, è stato eseguito un saggio cinetico da cui ricavare IC50 e Ki.
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