Riassunto analitico
Le Lytic Polysaccharide Monooxygenases (LPMOs) sono una nuova classe di enzimi coinvolti nella degradazione di biomasse recalcitranti, un processo che converte sottoprodotti dell’industria in monomeri e oligomeri che possono essere impiegati come materie prime per applicazioni microbiologiche, biomediche e alimentari. A livello industriale, la resa della produzione di queste proteine è un parametro chiave, direttamente collegato all’organismo atto alla produzione e alle condizioni di reazione, ovvero i principali aspetti da ottimizzare. Uno dei biopolimeri più abbondanti sulla Terra è la chitina, il principale componente di matrici quali l’esoscheletro di insetti ed artropodi, i gladi dei calamari e i gusci dei gamberi, tutti generati principalmente dall’industria alimentare. C. reinhardtii è una microalga unicellulare, un microrganismo fotosintetico che vive principalmente nelle acque dolci. Le microalghe sono un’alternativa valida e più green ad altri microrganismi, specialmente per la loro capacità di crescere su substrati economici e il loro stato di GRAS. Inoltre, il cloroplasto di C. reinhardtii è un sistema ormai consolidato per la produzione di proteina ricombinanti, con la disponibilità di molti strumenti genetici per l’ingegnerizzazione. In questo lavoro è stato sviluppato un saggio tramite ATR-FT-IR per l’identificazione dell’attività enzimatica e della specificità di substrato di una generica LPMO. Questi saggi sono solitamente basati su tecniche più dispendiose in termini di tempo e risorse, come HPLC e spettrometria di massa, mentre l’impiego della spettroscopia IR permette un’analisi qualitativa più economica e rapida. Questo metodo IR permette di identificare i prodotti della degradazione del substrato, quando presenti, ed è stato validato tramite altre tecniche analitiche. Per confermare ulteriormente la sua affidabilità, lo stesso metodo è stato testato su 3 proteine differenti: PpAA10, una LPMO di P. putida con attività specifica sulla chitina, prodotta sia in E. coli che in C. reinhardtii, e AoAA11, una LPMO di A. oryzae prodotta in E. coli. Lo scopo finale di questo lavoro è stato quello di applicare il metodo per analizzare l’attività enzimatica di PpAA10 dopo essere stata prodotta con successo per la prima volta in C. reinhardtii.
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Abstract
Lytic Polysaccharide Monooxygenases (LPMOs) are a recently discovered class of enzymes involved in the degradation of recalcitrant biomasses, a process that converts industrial by-products into monomers and oligomers which can be used as raw material for microbiological, biomedical and food applications.
On an industrial level, the production’s yield of these proteins is a core parameter, strictly correlated to the organism involved in the production and to the reaction’s conditions, which are indeed the most relevant aspects to be optimized.
One of the most abundant biopolymers is chitin, which is the main component of matrixes such as insects and arthropods’ exoskeletons, squid pens and shrimp shells, all of which are mainly generated from the food industry.
C. reinhardtii is a unicellular microalga, a photosynthetic microorganism which mainly lives into freshwater. Microalgae are a good and greener alternative to other organisms, especially for their ability to grow on cheap mediums and their GRAS status.
Furthermore, C. reinhardtii’s chloroplast is a well-established system for the production of recombinant proteins, with many genetic tools being available.
In this work, an assay has been developed to identify a LPMO’s enzymatic activity and substrate specificity via an ATR-FT-IR analysis.
Such assays are usually performed with time-consuming and expensive methods, like HPLC or Mass Spectrometry, while using IR allows for a quicker and cheaper qualitative analysis.
This IR method allows the identification of the substrate’s degradation products, when present, and was validated via other analytic techniques.
To further confirm its reliability, the same method was tested on three different proteins: a chitin-specific LPMO from P. putida, PpAA10, produced both in E. coli and in C. reinhardtii, and a chitin-specific LPMO from A. oryzae, AoAA11, produced in E. coli.
The final aim of this work was to apply the method to analyse the enzymatic activity of PpAA10 after being successfully produced in C. reinhardtii for the first time.
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