Riassunto analitico
L’elaborato di tesi è incentrato sulle small heat shock proteins (sHSP), una famiglia di proteine appartenenti al sistema di controllo di qualità delle proteine o protein quality control system (PQC), evoluto dalle cellule per mantenere il corretto stato di folding delle proteine sintetizzate.
Le sHSPs sono presenti in tutti i domini della vita e giocano un ruolo chiave nella resistenza allo stress. Strutturalmente le sHSP sono caratterizzate da un dominio alfa-cristallino (ACD) e da domini strutturalmente disordinati (IDR). I domini IDR conferiscono alle proteine che li contengono la capacità di mediare il processo di separazione di fase liquido-liquido ed organizzarsi in condensati macromolecolari, definiti organelli senza membrana (membrane-less organelles/MLO). Il ruolo dei domini IDR delle sHSP non è ad oggi ben caratterizzato ed esistono poche evidenze sperimentali a conferma che gli IDR possano indurre la separazione di fase liquido-liquido delle sHSP.
Recentemente il ruolo di proteine con domini IDR nel conferire resistenza a stress estremi è stato dimostrato utilizzando il tardigrado come modello animale. Il tardigrado è infatti capace di resistere a mancanza di gravità, radiazioni elevate, essiccazione. Ne consegue l’ipotesi che le sHSP siano putativi mediatori della risposta allo stress nei tardigradi e collaborino con altre proteine con domini IDR nel mediare la resilienza nei tardigradi.
Questo elaborato di tesi si pone lo scopo di caratterizzare dal punto di vista strutturale sei sHSP isolate dal tardigrado H. exemplaris e valutare la localizzazione subcellulare di due sHSP (BV898_14400 e BV898_16197) in cellule di mammifero in condizioni fisiologiche e di stress al fine di compararle con le sHSP umane ed evidenziare eventuali loro specifiche funzioni.
Le proteine di tardigrado sono state sottoposte ad un’analisi computazionale al fine di individuare domini IDR e prion-like. Le sequenze proteiche sono state allineate con database di domini appartenenti a famiglie proteiche per confermare la presenza del dominio ACD e ricercare altri domini strutturalmente definiti in grado di suggerire nuove funzioni delle proteine analizzate. L’analisi ha individuato il dominio ACD e diversi IDR in tutte le proteine, un dominio prion-like nella proteina BV898_06733 e altri domini proteici con minore significatività.
Le proteine di H. exemplaris clonate in vettori sono state trasfettate in cellule Hela e attraverso microscopia confocale è stato osservato che la proteina BV898_14400 presenta una localizzazione citoplasmatica e la proteina BV898_16197 si localizza in citoplasma e nucleo; entrambe le proteine si organizzano in foci simili a MLO.
Le cellule trasfettate sono state in seguito trattate con l’induttore di stress sodio arsenite per mediare la formazione di granuli da stress (SG), specifici MLO che si accumulano nei neuroni di pazienti affetti da sclerosi laterale amiotrofica. Alcune sHSP umane sono reclutate nei SG per indurne il disassemblaggio e mediare un effetto protettivo. Lo stesso è stato osservato per BV898_14400 e in parte per BV898_16197.
Le proteine BV898_14400 e BV898_16197 sono state confrontate con le sHSP umane per il reclutamento in SG e la formazione di MLO al fine di far emergere analogie o differenze. Si propone questo studio come primo tentativo di ricerca del dominio o processo che distingue le sHSP di tardigrado da quelle umane e conferisce loro una maggiore resilienza o il meccanismo presente nelle proteine di entrambe le specie ma potenziato in quelle di tardigrado. Il fine ultimo è lo sviluppo di un metodo che, mediante l’espressione di sHSP di tardigrado, conferisca a cellule di altre specie, come quelle umane, maggiore resistenza allo stress.
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