Riassunto analitico
Molti lieviti ibridi interspecifici trovano applicazione nelle biotecnologie alimentari, tuttavia, molti sono incapaci di riprodursi per via sessuale, precludendo l’utilizzo di programmi di breeding. Il complesso Zygosaccharomyces comprende diverse specie naturali interspecifiche e, tra queste, due sono state da poco sequenziate, aprendo una nuova era nella genomica funzionale e comparativa dei lieviti non convenzionali. Studi recenti ipotizzano che ibridi interspecifici di Zygosaccharomyces bailii ripristinano un ciclo sessuale completo in seguito al breakage di un allele del locus codificante il mating-type (MAT). Questo meccansimo evolutivo, responsabile del ripristino della fertilità nell’ancestore di Saccharomyces cerevisiae, risiede nella whole-genome duplication (WGD) avvenuta dopo l’ibridizzazione interspecifica. Zygosaccharomyces rouxii è una cell factory promettente per l’elevata tolleranza ad elevate concentrazioni di soluti. Occupa una posizione filogenetica peculiare nell’evoluzione degli emiascomiceti perché è il primo a divergere da S. cerevisiae prima della WGD.
Scopo di questa tesi è elucidare i meccanismi molecolari causa della sterilità nel lievito ibrido modello Z. rouxii ATCC42981, sviluppando strumenti di biologia sintetica e utilizzando le nuove tecniche di sequenziamento del genoma di terza generazione. Inizialmente, abbiamo studiato il ciclo vitale del ceppo tipo Z. rouxii CBS732T, focalizzandoci su come lo switching del mating-type agisca da meccansimo plastico che determina instabilità genetica intra individuo e novità fenotipiche in cellule aploidi derivanti da differenti colture stock del ceppo omotallico CBS732T. Poi, abbiamo caratterizzato il sistema determinante il sesso nell’allodiploide e sterile ATCC42981, utilizzandolo come modello per studiare come un assetto chimerico di geni MAT possa contribuire all’isolamento riproduttivo negli ibridi. Il sequenziamento del genoma di ATCC42981, integrando due piattaforme di sequenziamento diverse, Illumina MiSeq e Oxford Nanopore MinION, ci ha aiutato a decifrare le basi genetiche della sterilità negli ibridi e dell’adattamento a stress ambientali nei lieviti non convenzionali. L’assemblaggio iniziale è risultato in 33 scaffolds con una dimensione totale del genoma di 20.9 Mb; 10,254 geni sono stati annotati con Exonerate v2.2.0 per similarità al ceppo aploide più vicino CBS732T. Dal confronto con quest’ultimo è emerso che il genoma di ATCC42981 è 2.14 volte più grande di quello del CBS732T e contiene quasi il doppio dei geni. La predizione e annotazione dei geni è stata ulteriormente migliorata combinando metodi ab initio e basati sull’evidenza. 10,821 geni codificanti proteine sono stati annotati con Yeast Genome Annotation Pipeline (YGAP) e 10,521 usando la pipeline di Funannotate. Sulla base della sintenia degli scaffolds, dei geni ortologhi e omeomologhi, tre aplotipi sono stati identificati, uno di questi quasi identico al CBS732T, suggerendo un modello di ibridizzazione ripetuta. Il sequenziamento del genoma ha aiutato anche a risolvere l’organizzazione strutturale incongruente dei loci MAT tra due differenti colture stock di ATCC42981: la nostra sterile e quella giapponese fertile chimata JCM22060. L’ assetto dei loci MAT è divergnte e, a differenza di JCM22060, ATCC42981 ne trascive due. Abbiamo dimostrato che la delezione del locus MATα in ATCC42981 non è sufficiente a ripristinare l’ sporulazione o il mating, dato che l’incompleto silenziamento di HMLα maschera la perdita di eterozigosità nel locus MAT a seguito della delezione. Nel complesso, i nostri risultati contribuiscono a chiarire i meccanismi responsabili della sterilità negli ibridi e i circuiti che determinano l’identità cellulare nella specie pre-WGD Z. rouxii.
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Abstract
Many interspecies hybrid yeasts are exploited in food biotechnology, but most of them are asexual and can replicate only mitotically, hampering breeding programs.
Zygsaccharomyces clade includes several natural interspecies hybrids; currently two of them have been recently sequenced, opening a new era in functional and comparative genomics of these non-conventional yeasts. Recent studies have proposed that interspecies hybrids belonging to the Zygosaccharomyces bailii species complex can regain a complete sexual cycle by damage of one allele at the mating-type (MAT) locus. This evolutionary route is referred to as whole-genome duplication (WGD) after interspecies hybridization, and was supposed to be the mechanism occurred in an ancestor of Saccharomyces cerevisiae to rescue fertility.
Zygosaccharomyces rouxii is an industrial osmo and halo-tolerant promising cell factory that occupies a phylogenetic peculiar position in the hemiascomycetes lineage since it diverged from S. cerevisiae before WGD. The aim of this thesis is to elucidate the mechanisms underlying sterility in Z. rouxii model hybrid ATCC42981 by developing synthetic biology tools and third genome sequencing technologies (3GS). Firstly, we investigated the life cycle of the Z. rouxii haploid type-strain CBS732T, focusing on how mating-type switching acts as a plastic process that causes intra-strain genetic instability and phenotypic novelties in haploid cells derived from different homothallic CBS732T stock cultures. Secondly, we investigated the sex determination system of the Z. rouxii allodiploid and sterile ATCC42981 strain and used it as a model to study how a chimeric mating-type gene repertoire contributes to hybrid reproductive isolation. We performed draft genome sequencing of ATCC42981 combining Illumina MiSeq and Oxford Nanopore MinION platforms to decipher the genetic basis of the transcriptional network incompatibility underlying hybrid sterility and of the adaptation to high salt and sugar concentrations in non-conventional yeasts.
The initial assembly had 33 nuclear scaffolds with a cumulative size of 20.9 Mb; 10,254 genes were annotated by similarity to the closest Z.rouxii haploid relative CBS732T using Exonerate v2.2.0. Comparison with the type-strain showed that ATCC 42981 assembled genome had a 2.14 time larger size and almost twice genes number. The assembly completeness was supported by the content of near-universal single copy orthologs. Gene prediction and annotation were further refined combining ab initio and evidence based approaches. We annotated 10,821 protein-coding genes using the Yeast Genome Annotation Pipeline (YGAP) and 10,510 using Funannotate pipeline. Three haplotypes were dissected, one of them was identical to that of CBS732T, relaying on scaffold synteny mapping, as well as ortholog and homeomolog genes; suggesting a recursive hybridization model. The draft genome sequence assists us in resolving incongruences in mating-type like (MTL) loci organization between two different stock cultures of strain ATCC42981, namely our infertile in-house stock culture and the fertile Japanese sister stock JCM22060. Two different hybrid de novo genome assemblies were combined with in vitro long PCR approach to demonstrate that ATCC42981 exhibits a different assessment of MTL loci compared to JCM22060, retaining two transcriptionally active MAT cassettes. When MATα locus was deleted, the ATCC42981 MATa/- hemizygous mutant did not rescue the ability either to sporulate or mate, as incomplete HMLα silencing masks the loss of heterozygosity at the MAT locus induced by gene deletion. Overall, our findings contribute to elucidate the mechanisms of hybrid sterility and the circuits that determine cell identity in Z. rouxii pre-WGD species.
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