Riassunto analitico
La mielopoiesi è la parte della ematopoiesi che porta al differenziamento dei progenitori mieloidi derivanti da cellule staminali multipotenti in eritrociti, megacariociti, monociti e granulociti. Il differenziamento è correlato all'espressione genica differenziale e ai cambiamenti nell'architettura nucleare. In interfase, i cromosomi sono entità distinte note come territori cromosomici (TC) la cui disposizione radiale non è casuale. La loro vicinanza spaziale potrebbe aumentare la possibilità di riarrangiamenti come le traslocazioni, tipiche della Leucemia Mieloide Acuta (LMA). Le traslocazioni cromosomiche possono portare alla formazione di proteine di fusione anomale, solitamente fattori di trascrizione, le cui proprietà alterate possono provocare l'arresto del differenziamento. Nella leucemia promielocitica acuta, la t(15;17) produce la proteina di fusione PML-RARα che inibisce il differenziamento mieloide. La t(8;21) porta all’espressione di AML1-ETO nelle cellule leucemiche determinando un blocco differenziativo dei progenitori mieloidi. Da queste evidenze risulta che la mielopoiesi umana rappresenta un modello ideale per studiare la localizzazione dei cromosomi durante il differenziamento cellulare e l'impatto sulla insorgenza di riarrangiamenti cromosomici. Lo scopo di questo lavoro è l'analisi della localizzazione intranucleare dei TC implicati in traslocazioni leucemiche durante il differenziamento mieloide normale, nelle cellule staminali ematopoietiche umane (HSC), nei mieloblasti e nei monoblasti, attraverso l'uso di 3D-FISH. Per ogni traslocazione analizzata abbiamo selezionato cloni BAC che individuano i punti di rottura delle traslocazioni attraverso l’utilizzo del UCSC Genome Browser. Queste sonde e le WCP (Whole Chromosome Painting) specifiche per il TC selezionato, sono state testate su metafasi di sangue periferico per verificare la loro localizzazione. Successivamente le sonde sono state amplificate, marcate, precipitate e risospese nella mix di ibridazione. Le cellule staminali sono state purificate da sangue cordonale ombelicale attraverso gradiente Ficoll e successiva separazione immunomagnetica. I precursori mieloidi sono stati ottenuti in vitro dalla differenziazione di cellule staminali e successiva separazione immunomagnetica. Le cellule sono state fatte aderire su coprioggetto, fissate e permeabilizzate per la penetrazione della sonda. L'ibridazione è stata effettuata per 72 ore ed è stata seguita da rilevamento e colorazione DAPI. I campioni sono stati analizzati mediante microscopia confocale e le immagini ottenute sono state elaborate con il software ImageJ. La valutazione quantitativa della localizzazione dei TC rispetto al volume nucleare e dei relativi BAC è stato effettuato con eADS (enhance Absolute 3D Distances to Surfaces), un algoritmo basato su voxel. In primo luogo abbiamo valutato la localizzazione dei cromosomi nel nucleo. Essa è risultata sempre coerente con la distribuzione correlata alla densità genica. Questi risultati sono in linea con la letteratura secondo cui in cellule con nuclei sferici i cromosomi con maggiore densità genica hanno localizzazione più interna e viceversa. Abbiamo anche considerato se fosse possibile identificare un contesto cellulare più probabile per un evento traslocativo. Nel caso della coppia dei cromosomi 8 e 21 abbiamo osservato che la distanza dei cromosomi è inferiore nelle HSC, in accordo con un recente studio su linee cellulari e cellule leucemiche che dimostra che l'acquisizione della t(8;21) può avvenire anche nei progenitori o nelle HSC. Considerando invece la localizzazione dei cromosomi 15 e 17 il contesto più probabile sembrerebbe quello dei mieloblasti. Questo è il primo studio sulla localizzazione di territori cromosomici implicati in traslocazioni leucemiche durante la mielopoiesi umana normale e costituisce un quadro di lavoro rilevante per estendere lo studio ad altre traslocazioni leucemiche.
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Abstract
Myelopoiesis is the part of hematopoiesis leading the differentiation of myeloid progenitors, derived from multipotent stem cells, into erythrocytes, megakaryocytes, monocytes and granulocytes. The differentiation process is correlated with differential gene expression and changes in nuclear architecture. In interphase, chromosomes are distinct entities known as chromosome territories (CTs) whose radial arrangement is nonrandom. Their spatial proximity likely enhances the probability of chromosome rearrangement as translocations, typical of Acute Myeloid Leukemia (AML). Chromosomal translocations can result in the formation of abnormal fusion proteins, usually transcription factors, whose altered properties may cause the differentiation arrest. In acute promyelocytic leukemia, the t(15;17) produces a PML-RARα fusion protein which inhibits myeloid differentiation. The t(8;21) resulting in the expression of AML1-ETO transcript in leukemic cells. This fusion protein blocks differentiation of myeloid progenitors. By these evidences, human myelopoiesis represents an ideal model to investigate the localization of CTs during cell differentiation and the impact on determining chromosomal rearrangements. The aim of this work is the analysis of intranuclear localization of CTs implicated in leukemic translocations during human normal myelopoiesis in human hematopoietic stem cells (HSC), myeloblasts and monoblasts, with 3D-FISH. For each translocations analysed, we have selected human BAC clones which maps at translocation breakpoints using the UCSC Genome Browser. These probes and WCP (Whole Chromosome Painting) specific for the CT selected, were tested on peripheral blood metaphases to verify their localization. Subsequently the probes were amplified, labeled, precipitated and resuspended in the hybridization mix. Stem cells were purified from umbilical cord blood through Ficoll gradient and successive immunomagnetic separation. Myeloid precursors were obtained by in vitro differentiation of stem cells and subsequent immunomagnetic separation. The cells were made adherent on the coverslips, fixed and permeabilized probe penetration. Hybridization was carried out for 72 hours and followed by detection and DAPI staining. The samples were analyzed by confocal microscopy and the images obtained were processed using the software ImageJ. Quantitative evaluation of the position of the CTs in respect to the nuclear volume and the related BACs was performed using eADS (enhance Absolute 3D Distances to Surfaces), an algorithm based on voxels. We first evaluated the localization of chromosomes in the nucleus and we found that it is always consistent with a gene density correlated distribution. This is in line with literature which indicate that in cell with spherical nuclei chromosomes with higher gene density have a more internal localization and vice versa. We also considered if it’s possible to identify a more suitable cellular context for translocation. In the case of the chromosome couple 8 and 21, we observed that the distance of the chromosomes is shorter in the HSC, in accordance to a recent study on cell lines and leukemic cells that demonstrates that acquisition of t(8;21) can also occur in progenitors or in HSC. Considering instead the localization of chromosome 15 and 17, the more suitable context seem to be in myeloblast cells. This is the first study of the localization of CTs implicated in leukemic translocations during normal human myelopoiesis and constitutes a working framework relevant for future studies of other translocations involved in leukemia.
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