Riassunto analitico
Il carcinoma epatocellulare (HCC) è la terza causa di morte per cancro al mondo. L’HCC è un tumore iper-vascolarizzato, il suo esordio e la sua progressione sono strettamente connessi all’angiogenesi e alla transizione epitelio - mesenchimale (EMT), processi con i quali il tumore cresce e acquisisce caratteristiche invasive e di metastatizzazione. Il sistema angiopoietina2-tie2 ha un ruolo cruciale nella neo-angiogenesi. Angiopoietina2 (ANGPT2) è il gene leader in una firma trascrittomica epatica di cinque geni, che è un fattore predittivo di rapida crescita tumorale e prognosi infausta nei pazienti con HCC. ANGPT2 è iper-espressa, in HCC altamente vascolarizzati e scarsamente differenziati. L’effetto di ANGPT2 sull’angiogenesi è stato messo in relazione alla presenza del Fattore di Crescita dell’Endotelio Vascolare (VEGF), altro fattore pro-angiogenico, cruciale nella progressione dell’HCC. Recentemente è stato ipotizzato che l’azione sinergica tra ANGPT2 e VEGF aumenti lo stimolo a livello microvascolare, innescando la carcinogenesi. Tuttavia, il ruolo diretto di ANGPT2 e di VEGF sulle cellule di tumore epatico non è stato ancora ben studiato. Lo scopo di questo studio è stato valutare l’effetto di ANGPT2, da sola e con VEGF, nell’indurre la migrazione e l’EMT in una linea cellulare di HCC (HepG2). Lo sferoide è stato usato come modello 3D per fornire in vitro una rappresentazione più realistica del microambiente tumorale in vivo. Gli sferoidi sono stati trattati con dosi crescenti di ANGPT2 e/o VEGF per studiarne l’effetto sulla migrazione delle cellule che lo compongono. L’area di migrazione è stata misurata a 24 e 48 ore dalla stimolazione. Abbiamo osservato un aumento della migrazione con tutti i trattamenti rispetto agli sferoidi non trattati. In particolare, differenze significative rispetto al controllo sono state osservate con 200 ng/ml di ANGPT2, 200 ng/ml di VEGF e 100 ng/ml di ANGPT2 e VEGF combinati. Per valutare i cambiamenti nell’espressione dei marker dell’EMT (E-caderina, N-caderina, Twist e Vimentina), gli sferoidi sono stati stimolati al tempo 0 con le concentrazioni suddette. A 3 e 48 ore dalla stimolazione, l’espressione proteica è stata valutata mediante western blot e la localizzazione mediante immunofluorescenza. I nostri risultati mostrano un effetto rapido di ANGPT2 e VEGF combinati nel ridurre l’espressione di E-caderina a 3 ore dalla stimolazione, con una differenza significativa tra controllo e sferoidi trattati (p=0,0495). ANGPT2 e VEGF da soli riducono E-caderina anche se non significativamente rispetto al controllo. N-caderina aumenta significativamente con tutti i trattamenti rispetto al controllo a 3 ore dalla stimolazione (p=0,0109 per ANGPT2, p=0,0054 per VEGF, p=0,0348 per ANPT2 e VEGF insieme). A 48 ore, l’aumento si mantiene con tutti i trattamenti ma rimane significativo rispetto al controllo solo con la combinazione di ANGPT2 e VEGF (p=0,0049). Anche l’espressione di Vimentina aumenta a 48 ore dal trattamento in tutte le condizioni. Confrontando il controllo e i trattati a 48 ore dalla stimolazione, ci sono delle differenze significative nei trattamenti con VEGF da solo (p=0,0286) e combinato con ANGPT2 (p=0,05). L’espressione di Twist mostra una tendenza ad aumentare indipendentemente dal trattamento a 48 ore dalla stimolazione rispetto le 3 ore. Questi risultati avvalorano l’ipotesi di un ruolo per ANGPT2 e VEGF, da sole ma in modo più potente in combinazione, come trigger per la migrazione e l’EMT delle cellule. È degno di nota che alcuni marker dell’EMT (specialmente Vimentina e Twist) aumentano a 48 ore indipendentemente da ANGPT2 e/o VEGF, suggerendo un’attivazione dell’EMT indipendente dal trattamento e possibilmente legata alle condizioni delle colture 3D.
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Abstract
Hepatocellular Carcinoma (HCC) is the third leading cause of cancer mortality worldwide. HCC is a hyper-vascularized tumor and its onset and progression are closely linked to neo-angiogenesis and epithelial-mesenchymal transition (EMT) of cells. These processes allow the tumor to grow and acquire invasive characteristics, leading to the development of cancer metastasis.
The angiopoietin2-tie2 system has been shown to play a crucial role in neo-angiogenesis. Angiopoietin2 (ANGPT2) is the leader gene of a five gene hepatic transcriptomic signature, identified as predictor factor of rapid tumor growth and poor prognosis in HCC patients. It has been found overexpressed in highly vascularized and poorly differentiated HCCs. ANGPT2 effect on angiogenesis seems to be dependent on the presence of Vascular Endothelial Growth Factor (VEGF), another proangiogenic factor that has a critical role in HCCs metastasis and progression. Recently it has been hypothesized that the synergistic action between ANGPT2 and VEGF plays a relevant role in hepatocarcinogenesis increasing microvascular shear stress and triggering carcinogenesis. However, the direct role of ANGPT2 and VEGF on liver cancer cells has not been well investigated. The aim of this study was to evaluate the effect of ANGPT2, both alone and in combination with VEGF, in inducing migration and EMT in a HCC cell line (HepG2). Spheroids were used as a 3D model to provide a closer in vitro representation of spatial tumor microenvironment, recapitulating the morphology and the interactions of the tumor in vivo. Spheroids were treated with increasing concentrations of ANGPT2 and/or VEGF to study the effect of these proteins on migration of adherent spheroids. The migration area was then measured at 24 and 48 h from stimulation. We observed an increase in migration area with all treatments compared to the untreated spheroids. Significant differences were observed with 200 ng/ml of ANGPT2, 200 ng/ml of VEGF and 100 ng/ml of ANGPT2 and VEGF combined. To evaluate changes in the expression of EMT markers (E-cadherin, N-cadherin, Twist and Vimentin), spheroids were stimulated at time 0 with the concentrations above. At 3 and 48 h from stimulation, protein expression was assessed by western blots, and localization by immunofluorescence.
Our results showed a rapid effect of ANGPT2 and VEGF combined in reducing E-cadherin expression of cells at 3h from stimulation with a significant difference between control and treated spheroids (p=0,0495). ANGPT2 and VEGF alone decreased E-cadherin although not significantly vs. control. N-cadherin expression significantly increased with all treatments vs. control at 3h from stimulation (p=0,0109 for ANGPT2, p=0,0054 for VEGF, p=0,0348 for ANGPT2 and VEGF together). At 48h, the increase was maintained with all treatments, but there was a significant difference vs. untreated spheroids only with ANGPT2 and VEGF combined (p=0,0049). Vimentin expression also increased at 48h from stimulation in all conditions. Comparing control and treated spheroids at 48 h from stimulation, there were significant differences in VEGF treatment alone (p=0,0286) and combined with ANGPT2 (p=0,05). Twist showed a trend toward an increased expression at 48h respect to 3h from stimulation, independently of treatment.
These results support the hypothesis of a role for ANGPT2 and VEGF, individually but more powerfully in combination, as a trigger for migration and EMT of cells. It is of note that for the EMT biomarkers (especially Vimentin and Twist) an increase independent from ANGPT2 and/or VEGF occurred at 48 hours, suggesting the occurrence of EMT activation independently from treatment and possibly related to the conditions of 3D cultures.
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