• batteri
• deperibilità
• metagenomica
• microbiota
• sequenziamento

Il lavoro di tesi riguarda lo studio del microbiota di prosciutto cotto e salsiccia fresca confezionati in atmosfera protettiva (MAP), con il fine di ottenere nuovi target e intervenire sul processo di deterioramento. L’analisi del microbiota è stata condotta tramite una combinazione di metodi coltura dipendenti e indipendenti. Quest’ultimo si è avvalso di un approccio metagenomico basato su tecniche NGS, fondamentale per avere un’esaustiva analisi dell’ecosistema dei prodotti carnei considerati. L'approccio, che ha utilizzato la piattaforma Illumina, ha riguardato il sequenziamento della regione del gene 16S e la relativa caratterizzazione tassonomica, ed ha consentito di ottenere informazioni sull’abbondanza relativa di ciascuna OTU. Il metodo coltura-dipendente si è basato sull’isolamento dei microganismi su piastre di terreno selettivo, sulla clusterizzazione tramite RAPD-PCR e sulla caratterizzazione tassonomica mediante sequenziamento parziale del gene 16S. Lo studio è stato completato con un’indagine chimica dei composti organici volatili.
Nello studio del microbiota del prosciutto cotto, 14 lotti provenienti da diversi produttori siti in varie nazioni europee sono stati analizzati all’inizio della shelf-life (campioni S) ed alla fine (campioni E), conservati a 7°C per simulare un abuso termico. Sono stati esaminati anche 5 lotti con difetti riscontrati prima della scadenza (campioni R). La qualità dei prodotti E è risultata generalmente compromessa, con solo 4 lotti aventi caratteristiche sensoriali gradevoli. Il valore medio della carica microbica dei batteri lattici è passato da 2,9 log10 (cfu/g) nei campioni S a 7,7 log10 (cfu/g) nei campioni E ed R. I LAB coltivabili dominanti sono risultati ascrivibili alle specie L. sakei e L. carnosum. All’inizio della shelf-life sono prevalsi batteri appartenenti ai phyla Proteobacteria e Firmicutes e ai generi Acinetobacter, Brochothrix, Carnobacterium, Lactobacillus, Prevotella, Pseudomonas, Psychrobacter, Weissella e Vibrio rumoiensis. I campioni E ed R sono stati colonizzati principalmente da Firmicutes (Lactobacillales). Notevole la presenza di Leuconostoc, trascurabile negli S. In alcuni campioni, V. rumoiensis e B. thermosphacta hanno preso il sopravvento rispetto ai LAB. Inoltre, l’analisi dei VOCs ha evidenziato come l’etanolo rappresenti il principale metabolita prodotto durante la shelf-life.
Per lo studio del microbiota della salsiccia fresca sono stati esaminati 10 lotti di un unico prodotto fornito dallo stesso fornitore italiano. Anche in questo caso le analisi sono state condotte ad inizio e a fine shelf-life, conservando i prodotti a 7°C. Alla scadenza, solo 3 campioni non hanno presentato alterazioni sensoriali e il profilo delle componenti organiche volatili è risultato arricchito di alcoli, chetoni ed acidi originati dal metabolismo batterico. La carica microbica della frazione dei microorganismi aerobi ha subito un incremento da 4,7 a 6,6 log10 cfu/g, e i batteri lattici sono passati da 3,7 a 8,1 log10 cfu/g. Gli staphylococci, le enterobacteriacee, e le pseudomonas sono passati da 3,7 , 3,0 e 1,7 a 5,5, 4.8, e 3,0 log10 (cfu/g), rispettivamente. I batteri lattici coltivabili dominanti, genotipizzati mediante RAPD-PCR, sono risultati ascrivibili soprattutto alle specie L.curvatus/graminis, L.sakei, Leuconostoc carnosum e Leuconostoc mesenteroides. B. thermosphacta è stata la specie prevalente tra i batteri aerobi. L’analisi metagenomica ha evidenziato come nei campioni S prevalgano i gruppi Firmicutes e Bacteroidetes, la cui composizione è quella propria del tratto gastro-intestinale dei mammiferi. Inoltre, la maggior parte dei campioni E sono stati colonizzati da Firmicutes, con Lactobacillaceae e Listeriaceae quali famiglie più abbondanti.

The present thesis project focuses on the study of the microbiota of cooked ham and raw sausage packaged in modified atmosphere (MAP), with the aim to obtain new data which will be used to reduce the spoilage process. The microbiota was analyzed through a combination of culture-dependent and independent methods. The latter relies on an NGS-based metagenomic approach, which is essential to get a more comprehensive overview of complex ecosystems such as the meat microbiota. It relies on the sequencing of the specific 16S rRNA region and it is implemented by using the Illumina platform. The analysis and the taxonomic characterization of sequences made it possible to obtain data about the number of reads associated to each OTU. The culture-dependent method was based on the isolation of microorganisms on selective medium plates, on RAPD-PCR clustering and taxonomic characterization by partial sequencing of the 16S gene. The study was completed with a volatile organic compounds analysis. During the study of the cooked ham microbiota, 14 lots from several producers located in different European countries were analysed both within a few days from packaging (S samples) and at the end of the shelf-life (E samples), stored at 7°C to simulate a thermal abuse. 5 lots, showing defects found before the expiration date were also included in the study (R samples). Quality of the E products was compromised, with only 4 lots remaining unaltered. LAB load had a mean value of 2.9 log10 (cfu/g) in S samples and increased to 7.7 log10 (cfu/g) in E and R samples. Dominant cultivable LAB belonged to the species L. sakei and L. carnosum. At the beginning of the shelf-life, Proteobacteria and Firmicutes dominated the microbiota, with Acinetobacter, Brochothrix, Carnobacterium, Lactobacillus, Prevotella, Pseudomonas, Psychrobacter, Weissella, Vibrio rumoiensis occurring frequently and/or abundantly. E and R samples were colonized mainly by Firmicutes (Lactobacillales). The presence of Leuconostoc was noteworthy, while it was negligible in S samples. In some samples, V. rumoiensis and B. thermosphacta dominated LAB. Moreover, VOCs analysis revealed that ethanol was the major metabolite produced during the shelf-life. Conversely, during the study of raw sausage microbiota 10 lots of the same product and provided by the same supplier were analysed. Again, analysis were carried out at the beginning and at the end of the shelf-life, storing the products at 7°C. At the end of the shelf-life, only 3 samples showed no significant alterations. The VOCs profile got enriched with alcohols, ketones, and acids resulting from microbial metabolism. Aerobic bacteria increased from 4.7 to 6.6 log10 (cfu/g), and LAB from 3.7 to 8.1 log10 (cfu/g). Staphylococci, enterobacteria, and pseudomonads passed from 3.7, 3.0, and 1.7 to 5.5, 4.8, and 3.0 log10 (cfu/g), respectively. Dominant cultivable LAB, genotyped by RAPD-PCR, belonged to the species L.curvatus/graminis and L. sakei, together with Leuconostoc carnosum and Leuconostoc mesenteroides. B. thermosphacta was the prevailing species among aerobic bacteria. The metagenomic analysis highlighted that the microbiota of S samples clustered in Firmicutes or Bacteroidetes groups and was ascribed to taxa generally associated to the gastro-intestinal tract of mammals. Moreover, most E samples were colonized by Firmicutes, with Lactobacillaceae and Listeriaceae among the most abundant families.