Riassunto analitico
La resistenza batterica è una delle principali minacce alla salute umana ed è ormai riconosciuta dall’Organizzazione Mondiale della Sanità come una priorità su scala mondiale richiedente urgenti interventi e azioni multisettoriali.
Dai dati epidemiologici forniti dal report del sistema di sorveglianza EARS-Net del 2019 emerge come questo problema coinvolga anche antibiotici di ultima generazione come cefalosporine di terza generazione e carbapenemi. La resistenza ai carbapenemi è aumentata più di sette volte dal 2006 per diversi paesi EU/EAA, particolarmente nel Sud e Centro Europa.
E’ noto da tempo come alla base di questo fenomeno vi sia l’utilizzo non corretto dei farmaci antibiotici e la difficoltà di accesso a una diagnosi rapida dell’infezione, del microrganismo responsabile e dei suoi profili di resistenza.
I batteri presentano diversi meccanismi di resistenza agli antimicrobici: tra questi l’espressione degli enzimi ß-Lattamasi in grado di idrolizzare gli antibiotici ß-lattamici, tra i piu’ prescritti, inattivandoli.
Le ß-Lattamasi sono suddivise nelle classi A, B, C e D.
Le classi A, C e D sono enzimi serino-dipendenti, mentre le ß-Lattamasi di classe B sono enzimi metallo-based. Ad oggi, sono disponibili in terapia esclusivamente inibitori di serina-ß-lattamasi mentre nessun inibitore contro le metallo-ß-lattamasi è stato ancora approvato.
In questo scenario, il mio progetto di tesi verte sulla ricerca di nuovi inibitori attivi contro le carbapenemasi di tipo B, in particolare NDM-1 e VIM-2.
Sulla base di questo, è stata testata l’efficacia in-silico ed in vitro su queste due proteine target, di una libreria di inibitori chimici in house resi disponibili dalla Cornell University.
I test in-silico sono stati condotti mediante il docking molecolare (GLIDE) della libreria di molecole, sull’enzima VIM-2, preceduto da studi preliminari riguardanti in particolare le molecole di acqua coinvolte nel meccanismo catalitico e la flessibilità del sito attivo.
I risultati ottenuti dal docking su VIM-2 sono stati confrontati con quelli ottenuti dal docking molecolare, della stessa libreria, eseguito precedentemente su NDM-1, al fine di individuare eventuali inibitori attivi su entrambi gli enzimi e quindi, potenzialmente broad-spectrum.
Le molecole selezionate tra quelle in esame sono state validate in vitro su NDM-1 mediante un’analisi spettrofotometrica UV-VIS; per le molecole risultate attive, è stata eseguita una analisi comparativa della posa di docking nel sito attivo di NDM-1, e di VIM-2, al fine di analizzare le eventuali basi di riconoscimento molecolare comuni alle due proteine o piuttosto la capacità per una stessa molecola di inibire le due MBLs con orientazioni di legame differenti nei due enzimi.
Per i composti più promettenti individuati in-vitro, sono poi stati determinati i valori di IC50 e calcolate le Ki.
Sono ora in corso studi di cristallizzazione con le proteine targets.
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Abstract
Bacterial resistance is one of the major threats to human health and is now recognized by the World Health Organization as a global priority requiring urgent multisectoral interventions. Epidemiological data from the 2019 EARS-Net surveillance report highlights how this problem involves even the latest generation antibiotics such as third-generation cephalosporins and carbapenems. Resistance to carbapenems has increased over sevenfold since 2006 in several EU/EEA countries, particularly in Southern and Central Europe. The improper use of antibiotic drugs and the difficulty in promptly diagnosing the infection, identifying the responsible microorganism, and its resistance profiles have long been acknowledged as underlying factors in this phenomenon.
Bacteria have various mechanisms of resistance to antibiotics, including the expression of ß-lactamase enzymes capable of hydrolyzing ß-lactam antibiotics, among the most commonly prescribed, rendering them inactive. ß-lactamases are categorized into Classes A, B, C, and D. Classes A, C, and D are serine-dependent enzymes, while Class B ß-lactamases are metallo-based enzymes. To date, while inhibitors against serine-ß-lactamases are available in therapy, there is no approved inhibitor against metallo-ß-lactamases yet.
In this context, my thesis project focuses on the research of new active inhibitors against type B carbapenemases, particularly NDM-1 and VIM-2. My work focused in the virtual screening of an in house database of chemicals made available by Cornell University searching for candidates active vs MBL. Selected compounds have been then validated in vitro against the two targeted proteins.
In-silico tests were conducted by molecular docking (GLIDE) screening a library of around 800 compounds vs VIM-2. Preliminary studies were conducted for the selection of key water molecules involved in the catalytic mechanism and the most flexible regions of the protein. Results from docking on VIM-2 were compared with those previously obtained vs NDM-1 in order to identify broad spectrum inhibitors active against both enzymes. The selected molecules were then tested in vitro vs NDM-1 through UV-VIS spectrophotometric analysis. For most active molecules, a comparative analysis of the docking poses in the active site of NDM-1 and VIM-2 was carried out to analyze common molecular recognition motifs or the ability of a molecule to inhibit both MBLs but with different binding orientations. IC50 values and Ki were then determined for the most promising compounds identified in-vitro. Crystallization studies with the target proteins are currently ongoing.
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