Riassunto analitico
Recentemente, gli estratti di Cannabis sativa hanno attratto molta attenzione per il loro potenziale uso nel trattamento dell’epilessia. Uno dei più importanti principi attivi contenuti nelle infiorescenze femminili di C. sativa è il cannabidiolo (CBD), inizialmente considerato un cannabinoide inattivo. Al contrario, il CBD è caratterizzato da forti attività antiossidanti ed antinfiammatorie, oltre a proprietà neuroprotettive, ansiolitiche ed anticonvulsivanti. Oltretutto, estratti ricchi in CBD sembrano sfruttare la presenza di composti che sono assenti nel CBD purificato, come i terpeni, grazie ad un meccanismo sinergico dal nome “effetto entourage”. In questa tesi abbiamo valutato l’efficacia del CBD e di composti correlati al CBD nel ratto trattato con acido kainico, modello di epilessia cronica e nel modello murino di stimolazione a 6-Hz.
Gli effetti terapeutici del CBD sono stati valutati attraverso analisi video-elettrocorticografiche (v-ECoG) su ratti epilettici precedentemente trattati con acido kainico. In seguito, sono stati esaminati i livelli intra ed extra ippocampali del recettore gamma attivato dai proliferatori dei perossisomi (PPAR-γ), in risposta al trattamento con CBD. In particolare, lo stato epilettico (SE) è stato indotto in 30 ratti Sprague-Dawley, attraverso un’iniezione intraperitoneale di acido kainico (15 mg/kg). Dieci settimane dopo, gli animali epilettici sono stati trattati con CBD ad alta (120 mg/kg, n=10) o bassa dose (12 mg/kg, n=10), oppure con olio MCT (n=10), 2 volte al giorno per 3 giorni. 6 ratti non epilettici e non trattati sono stati usati come controlli. In confronto al pretrattamento, 5 ratti su 10 non hanno manifestato crisi spontanee ricorrenti (SRSs) durante il trattamento con il CBD a 120 mg/kg (p=0.033, Fisher’s exact test) ed il numero totale di crisi è stato significativamente ridotto in mediana da 5 (2 ̶ 11.5) a 0 (0 ̶ 2.5) (p<0.05, Dunn's Method). In più, lo stesso dosaggio di CBD ha ridotto la durata delle SRSs (p<0.05, Holm-Sidak test). Rispetto ai controlli, i livelli di PPAR-γ sono significativamente aumentati nell’ippocampo (CA3, p<0.001; CA1, p<0.05), subiculum (p<0.05), amigdala (p<0.05) e nella corteccia peririnale (p<0.05) dei ratti trattati con alte dosi di CBD. Il CBD a basse dosi è stato in grado di aumentare l’espressione di PPAR-γ, ma questo effetto è stato limitato alle aree ippocampali (p<0.05).
In un altro esperimento, è stato valutato un estratto di un ceppo di C. sativa nel modello murino di stimolazione corneale a 6-Hz, usato di norma per identificare nuovi farmaci con attività potenziale contro epilessie farmacoresistenti. Un’ora prima della stimolazione, gli animali da trattare (n=24) hanno ricevuto somministrazioni quotidiane di olio d’oliva, di olio di canapa (HO) con concentrazione di CBD di 25 mg/kg, o di CBD purificato allo stesso dosaggio. Dopo 5 giorni di trattamento e monitoraggio v-ECoG, i topi sono stati sacrificati e l’attivazione neuronale è stata valutata con immunoistochimiche contro FosB/ΔFosB. Il numero di topi con crisi convulsive è stato più basso a seguito del trattamento con HO, rispetto a quello con CBD (p<0.05, Fisher’s exact test). Inoltre, HO ha anche limitato l’attivazione neuronale nel subiculum (p<0.05; Duncan's Method).
I risultati di entrambi i disegni sperimentali hanno, in primo luogo, supportato il CBD come strumento terapeutico efficace in un modello di epilessia cronica; in secondo luogo, hanno sottolineato l’importanza dell’effetto mediato dai terpeni negli estratti di cannabis, che dovrebbe sicuramente essere considerato in fase di progettazione di farmaci a base di cannabinoidi.
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Abstract
Cannabis sativa extracts have recently attracted much attention for their potential use in the treatment of epilepsy. One of the two most important active principles contained in feminine blossoms of C. sativa is cannabidiol (CBD). At first, it was considered an inactive cannabinoid, in contrast to 9-tetrahydrocannabinol (Δ9-THC), but, as a matter of fact, CBD is characterized by strong antioxidant and anti-inflammatory activities, together with analgesic, neuroprotective, anxiolytic and anticonvulsant properties. Moreover, CBD-rich extracts seem to take advantage of the presence of compounds that are absent in purified CBD, like the terpenes, thanks to a proposed synergistic effect called “entourage effect”. In this thesis, we evaluated the effectiveness of CBD and CBD-related compounds in the kainic acid model of chronic epilepsy and in 6-Hz stimulation model.
To this aim, the therapeutic effects of CBD have been assessed through video-electrocorticographic (v-ECoG) analysis in epileptic rats previously treated with kainic acid. Then, the hippocampal and extrahippocampal levels of the peroxisome proliferator-activated receptor gamma (PPAR-γ) were evaluated in response to treatment with CBD. Particularly, status epilepticus (SE) has been induced in male Sprague-Dawley rats (n = 30) with an intraperitoneal injection of kainic acid (15 mg/kg). Ten weeks later, these epileptic animals were treated with a high (120 mg/kg, n = 10), or low (12 mg/kg, n = 10) dose of CBD, or with MCT oil (n = 10), twice a day for 3 days. Six non-epileptic non-treated animals were used as controls. In comparison to the pre-treatment, 5 out of 10 rats did not display spontaneous recurrent seizures (SRSs) during the treatment with 120 mg/kg CBD (p = 0.033, Fisher’s exact test). During the pre-treatment, the total number of seizures was 5 at median (2 ̶ 11.5), and it was significantly reduced to 0 (0 ̶ 2.5) by the administration of 120 mg/kg of CBD (p < 0.05, Dunn's Method). Additionally, the same dose of CBD reduced the duration of SRSs (p < 0.05, Holm-Šidák test). In comparison to non-treated controls, PPAR-γ levels were significantly increased in the hippocampus (CA3, p < 0.001; CA1, p < 0.05; Holm-Šidák test), subiculum (p < 0.05), amygdala (p < 0.05), and perirhinal cortex (p < 0.05) of rats treated with high doses of CBD. CBD at low doses could also increase the expression of PPAR-γ, but this effect was limited to the hippocampal fields (p < 0.05, Holm-Šidák test).
In another experiment, an olive oil-based extract from a non-psychoactive C. sativa strain has been screened in the 6-Hz corneal stimulation mouse model, commonly used to identify new antiseizure medications (ASMs) with potential action on drug-resistant epilepsies. The animals to be treated (n = 24) were divided into 3 groups and received daily oral administrations of olive oil, hemp oil (HO) with fixed concentration of CBD (25 mg/kg), or purified CBD (25 mg/kg), 1 hour before the corneal stimulation. After 5 days of treatment and v-ECoG monitoring the animals were sacrificed, and the neuronal activation was evaluated through immunohistochemical assays towards FosB/ΔFosB. Interestingly, the number of animals manifesting convulsive seizures was lower after the treatment with HO (p < 0.05, Fisher’s exact test), which also limited neuronal activation in the subiculum (p < 0.05; Duncan's Method).
The findings from both experimental settings, firstly, indicate CBD as an effective therapeutic instrument in a model of chronic epilepsy; secondly, underline the importance of the entourage effect brought on by terpenes in cannabis extracts, that should definitely be considered during the design of cannabinoids-based drugs.
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