Riassunto analitico
Вeta-hemoglobinopathies are caused by mutations affecting the production of the adult hemoglobin β-chain. The co-inheritance of mutations causing fetal γ-globin expression in adult life (hereditary persistence of fetal hemoglobin, HPFH) ameliorates the disease phenotype. We previously reported adenine and cytidine base editing mediated introduction of HPFH mutations with minimal off-target activity, which led to therapeutic fetal hemoglobin levels in red cells differentiated from sickle cell disease or β-thalassemia hematopoietic stem/progenitor cells. Serial xenotransplantation experiments showed base editing in long-term hematopoietic stem cells; however, the efficiency was reduced compared to input cells. To increase the fitness of edited hematopoietic stem cells and editing efficiency, we used histone deacetylases, RNases and apoptosis inhibitors. Moreover, we developed strategies to enrich edited cells. By way of example, two rounds of RNA electroporation led to increased base editing efficiency with minimal toxicity. Furthermore, highly processive base editors outperformed the original enzymes even upon only one round of electroporation. In conclusion, we identified key elements that improved the base editing efficiency in hematopoietic stem/progenitor cells to enable the clinical development of base editing strategies for the treatment of β-hemoglobinopathies.
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Abstract
Le β-emoglobinopatie sono causate da mutazioni che colpiscono il gene codificante la catena β dell'emoglobina adulta. La coereditarietà di mutazioni che causano l'espressione della γ-globina fetale nella vita adulta (Hereditary Persistence of Fetal Hemoglobin, HPFH) migliora il fenotipo della malattia. In precedenza, abbiamo riportato l'introduzione di mutazioni causative della HPFH mediata da adenine e cytosine base editing con un'attività off-target minima, che ha portato a livelli terapeutici di emoglobina fetale in globuli rossi differenziati da cellule ematopoietiche staminali/progenitrici (hematopoietic stem/progenitor cells, HSPC) di individui affetti da anemia falciforme o β-talassemia. Esperimenti seriali di xenotrapianto hanno mostrato la presenza di cellule ematopoietiche staminali geneticamente modificate a lungo termine; tuttavia, l'efficienza risultava ridotta rispetto alle cellule coltivate in vitro. Per aumentare la fitness delle ematopoietiche staminali geneticamente modificate e l'efficienza dell'editing, abbiamo utilizzato inibitori delle istone deacetilasi, delle RNasi e dell'apoptosi. Inoltre, abbiamo sviluppato strategie per arricchire le cellule modificate. A titolo di esempio, due cicli di elettroporazione dell'RNA hanno portato a una maggiore efficienza di base editing, con una tossicità minima. Inoltre, i nuovi base editors iperattivi hanno mostrato un’efficienza maggiore rispetto agli enzimi originali anche con un solo ciclo di elettroporazione. In conclusione, abbiamo identificato elementi chiave che hanno migliorato l'efficienza di base editing nelle HSPC, per consentire lo sviluppo clinico di strategie di base editing per il trattamento delle β-emoglobinopatie.
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