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Le nanoparticelle solide lipidiche, note come “SLNs”, sono un'importante classe facente parte della famiglia delle nanoparticelle lipidiche. Esse sono state proposte da Muller nel 1990 e rappresentano una delle innovazioni tecnologiche che possono esser utilizzate per veicolare farmaci dal carattere idrofobico. Al giorno d’oggi hanno acquisito un interesse maggiore visto il loro impiego nei vaccini formulati per far fronte alla pandemia COVID-19. In questo progetto l’obiettivo è stato quello di utilizzare le SLNs come veicolo per siRNA ossia materiale genico con caratteristiche idrofiliche.
siRNA o small interfering RNA è un importante frammento di RNA che può essere impiegato per il silenziamento genico. Infatti, grazie al suo meccanismo d’azione è in grado potenzialmente di silenziare un gene target. Infatti è stato studiato come potenziale agente terapeutico per diverse patologie come i tumori, infezioni virali, tra cui infezioni da SARS-19 ed malattie neurodegenerative. Un esempio di un farmaco a base di siRNA usato a livello clinico e approvato da FDA ed EMA è “Onpattro”, approvato nel 2018 per il trattamento della amiloidosi ereditaria da transtiretina (hATTR) con polineuropatia allo stadio 1 o 2 e rappresenta la prima terapia a RNA.
Per potere utilizzare il siRNA come silenziatore genico è necessario superare una serie di ostacoli legati per lo più alle sue caratteristiche chimico fisiche, Di fatti se iniettato come tale, il siRNA va incontro ad un processo di degradazione da parte delle nucleasi plasmatiche oltre il fatto che non può attraversare la membrana plasmatica visto il suo peso molecolare e la sua carica elettrica negativa, che crea una repulsione elettrostatica con la membrana cellulare. Per ovviare a tutto ciò è importante che il siRNA venga incapsulato oppure adeso sulla superficie di nanovettori come le SLNs. Per fare ciò si ricorre spesso ad utilizzare, nella formulazione delle SLN, sostanze cariche positivamente in grado di legare il siRNA elettrostaticamente. Tra queste la più conosciuta è il DOTAP o meglio 1,2-Dioleoil-3-trimetilammonio propano, un tensioattivo di carattere cationico.
Alla luce di questi dati, sono state proposte 2 strategie d’incorporazione: la prima consiste nella nanoincapsulazione mentre la seconda nell’adesione del siRNA sulla superficie di SLNs preformate. Le SLNs sono state quindi formulate, rispettivamente, adottando 2 tecniche principali ossia: il metodo della doppia emulsione e il metodo dell’omogeneizzazione a caldo seguita da dispersione mediante ultrasuoni. Tutte le formulazioni sono poi state sottoposte a liofilizzazione.
A seguito, gli studi di caratterizzazione chimico fisica sono stati effettuati sia prima che dopo la liofilizzazione. In particolare, tutte le formulazioni ottenute sono state caratterizzate in termini di dimensioni, carica superficiale ed indice di polidispersione (PDI). Inoltre, mediante la tecnica del Ribogreen assay è stato possibile quantificare il siRNA incapsulato o adeso sulla superficie determinando l’efficienza d’incapsulazione (EE%).
Gli studi di stabilità sono stati condotti ponendo il siRNA in una miscela di solventi organici ossia diclorometano ed etil-acetato in un rapporto 1:1 v/v, normalmente utilizzati nelle formulazioni, sotto agitazione ad ultrasuoni. L’obiettivo era quello di determinare se il siRNA è stabile o meno alle condizioni di formulazione.
Dagli studi di caratterizzazione chimico fisica e quantificazione si evince che le SLNs formulate con la tecnica di omogenizzazione a caldo a cui successivamente è stato adeso il siRNA presentano migliori caratteristiche in termini di dimensione, carica superficiale e PDI nonché una quantificazione maggiore. Questi dati concordano perfettamente con gli sudi di stabilità che mostrano come la presenza di solventi organici così come la sonicazione possano influenzare in senso negativo l’incapsulazione del siRNA.

Solid Lipid Nanoparticles or rather SLNs are one of the members of the lipid-based nanocarriers family. They were proposed by Muller in 1990 and represent one of the main vehicles used to deliver hydrophobic drugs. Nowadays they have gained more interest owing to their use in COVID-19 vaccines. The goal of this project is to use SLNs as a vehicle for siRNA i.e., a hydrophilic molecule. siRNA or small interfering RNA is an important element for gene silencing or interfering RNA. In fact, due to its mechanism of action it is potentially able of silencing any target gene. This elicits the interest of various researchers who began to investigate its pharmacological properties for various diseases such as cancer, viral infections including SARS-19 infections, and neurodegenerative diseases. A clinical example of a siRNA-based therapy that has been recently approved by FDA and EMA is Onpattro. This was approved in 2018 for the treatment of hereditary transthyretin amyloidosis (hATTR) with stage 1 or 2 polyneuropathy and represents the first RNAi therapy. In order to be able to use siRNA as an RNAi therapy, it is necessary to overcome several drawbacks mostly related to its chemical and physical characteristics, in fact, free siRNA once injected, undergoes a process of degradation by plasma nuclease in addition to the fact that it cannot cross the membrane given its molecular weight and negative charge that creates an electrostatic repulsion with the cell membrane. To overcome this, siRNA must be encapsulated or absorbed to the surface of SLNs, using positively charged molecules that can bind siRNA electrostatically. Among them the best known is DOTAP or rather 1,2-Dioleoyl-3-trimethylammonium propane, a surfactant of a cationic character. According to these data, our research group, proposed 2 different encapsulation strategies: the nanoincapsulation and siRNA absorbtion on the surface. Therefore, the SLNs were prepared following 2 main techniques, respectively: the method of double emulsion and the method of hot homogenization and ultrasonication, both previously validated in the laboratory. All formulations were lyophilized. The obtained nanoparticles were characterized in terms of size, polydispersity index (PDI) and zeta potential before and after freeze-drying. Furthermore, the encapsulation efficiency (EE%) was determined by using the Ribogreen assay. Stability studies were performed under sonication in organic solvents: ethyl-acetate and dichloromethane (1:1 v/v) normally used in the formulation. In this case, the goal was to determine either siRNA is stable or not to sonication and organic solvents. In conclusion, according to physical chemical characterization and quantification studies, the most successful SLNs-siRNA were developed using the hot homogenization and ultrasonication method followed by siRNA absorbtion on the surface. These results were in accordance with the stability studies. In fact, siRNA degrades in the conditions applied during the formulation of SLNs making the EE% lower compared to the case in which siRNA is simply absorbed on the SLN surface.