Riassunto analitico
Il ritmo circadiano giornaliero è regolato da geni definiti “clock” attraverso meccanismi molecolari altamente conservati ed ubiquitari in cellule di mammifero. In cellule della granulosa umane (hGLC), il pattern di espressione del gene CLOCK è connesso all’azione di due gonadotropine, l’ormone luteinizzante (LH) e la gonadotropina corionica (hCG), le quali agiscono attraverso un recettore comune (LHCGR) mediando differenti effetti fisiologici tra i quali la produzione di progesterone. La sintesi di tale ormone avviene mediante attivazione di cAMP a livello intracellulare, nonché fosforilazione di cAMP responsive element binding protein (pCREB) e trascrizione di geni target codificanti per enzimi che regolano la steroidogenesi. Mentre LH interviene durante una fase di ciclicità fisiologica nella donna in età fertile, ossia regola il ciclo mestruale, la gonadotropina corionica umana è l’ormone della gravidanza e, in un certo senso, interviene disaccoppiando le funzioni ovariche dalla regolazione ciclica azionata a livello centrale. Lo scopo di questa tesi è quello di valutare l'effetto del gene CLOCK sulla risposta cellulare LH- e hCG-specifica in hGLC e nella linea cellulare HEK293, quale modello per gli studi funzionali. Le cellule HEK293 hanno permesso di confermare risultati precedentemente ottenuti, i quali, mediante metodica bioluminescence resonance energy transfer (BRET), dimostrano che l’attivazione di cAMP è ciclica e caratterizzata da picchi ogni 3-4 ore. Le hGLC sono state trattate o meno con small interfering RNAs (siRNA), inibenti i trascritti del gene CLOCK, quindi è stata valutata l’attivazione dei segnali steroidogenici intracellulari, nonché la sintesi del progesterone LH/hCG-mediata, nell’arco di 24 ore. L’efficacia del siRNA è stata controllata mediante analisi della presenza di cDNA codificante il gene CLOCK, utilizzando real-time PCR. La trascrizione dei geni STARD1, codificante l’enzima regolatore della steroidogenesi StAR, è stata valutata allo stesso modo, normalizzando il segnale sull’espressione del gene RPS7. La cinetica di attivazione di pCREB è stata valutata mediante Western Blotting, mentre la produzione di progesterone mediante saggio immunometrico. I dati ottenuti evidenziano una significativamente diversa produzione di cAMP indotta da LH e hCG dopo 18 ore di stimolazione in HEK293 di controllo, mentre la deplezione dell’espressione del gene CLOCK mediante siRNA è associata a simile produzione di cAMP LH- o hCG-dipendente. Tale risultato riflette una simile cinetica di accumulo di progesterone in hGLC trattate con siRNA inibente CLOCK.Questo studio dimostra che il gene CLOCK è implicato nella regolazione della risposta cellulare in seguito a stimolazione con gonadotropine in vitro.
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