• Cholesterol
• Gene therapy
• Lipid nanoparticles
• Microfluidic
• Scale-up

L’applicazione dei recenti progressi tecnologici in ambito medico ha portato all’utilizzo della nanomedicina per delineare migliori approcci terapeutici nei confronti di patologie per le quali le terapie convenzionali spesso non offrono soluzioni definitive. Nonostante le recenti approvazioni di numerose terapie a base di nanoparticelle (NP), la maggiore limitazione rimane lo scale-up industriale di queste formulazioni, che spesso restano un prodotto di laboratorio.
Sulla base di promettenti risultati ottenuti in precedenza dal NanotechLab con NP a base di colesterolo (CHOL) direzionate al cervello per trattare la còrea di Huntington (HD), questo studio punta a migliorare la produzione di NP proponendo un approccio adatto alla produzione industriale. HD è una patologia genetica neurodegenerativa che causa la produzione di una proteina anomala detta huntingtina (HTT), ma recenti studi hanno anche evidenziato una riduzione nella sintesi di CHOL che concorre alla degenerazione neuronale. La somministrazione di CHOL all’encefalo con NP si è dimostrata efficace nel ripristinare le funzioni motorie e cognitive in modelli di topo, tuttavia queste formulazioni rimangono difficilmente scalabili.
In quest’ottica, questo studio indaga l’utilizzo della microfluidica, una tecnica industriale, per la formulazione di CHOL NP. Inoltre, considerato l’incredibile potenziale della gene therapy nel trattamento di patologie genetiche come l’HD, un secondo obiettivo riguarda la produzione di CHOL NP ottimizzate e caricate con siRNA per un duplice effetto: da un lato il siRNA ridurrà la produzione della HTT anomala, dall’altro la composizione unicamente a base di CHOL andrà a ristabilire le concentrazioni nei neuroni danneggiati. In un primo momento, lo screening è stato svolto con una syringe pump per analizzare l’influenza dei parametri operativi sulla formazione delle NP, andando a delineare formulazioni ottimali in termini di flow rate ratios, concentrazioni di CHOL e tensioattivo, andando ad ottimizzare la concentrazione di CHOL per massimizzare il dosaggio della formulazione finale. Nell’ottica di caricamento di materiale genico, NP cationiche sono state formulate utilizzando un derivato sintetico del CHOL (DC-CHOL). Infine, sono state fatte prove di incapsulazione utilizzando una sequenza non terapeutica di siRNA per determinare l’idoneità del metodo a tale scopo. Una volta identificati i candidati ottimali, il metodo è stato traslato su un sistema Automated NanoParticle adatto alla produzione in microfluidica su scala industriale, e un secondo screening è stato svolto per ottimizzare gli ultimi parametri operativi.
Tutte le NP sono state caratterizzate in termini di size, indice di polidispersione, potenziale zeta, stabilità alla conservazione a 4°C e -20°C (con e senza crioprotettore), e per i migliori candidati sono state analizzate resa ponderale e morfologia. Sono state inoltre calcolate le efficienze di incapsulazione delle NP formulate con i due diversi strumenti, confrontando e analizzando il loro impatto nella produzione delle particelle e nel caricamento di materiale genico.
Oltre ad essere un’ulteriore conferma della grande potenzialità delle nanomedicine nel progettare nuovi approcci terapeutici e dell’utilità della microfluidica per la produzione industriale di NP, questo studio si presenta come un ottimo punto di partenza nel design di particelle per terapia genica mirata nei confronti della HD, offrendo una nuova, promettente alternativa nella cura di questa patologia. Studi futuri riguarderanno test in vitro e in vivo con una sequenza terapeutica per HTT, nella speranza di arrivare alla produzione di una nanoformulazione efficace.

The application of recent technological advancements in medicinal research led to the use of nanomedicine, aimed at more efficiently treating hard-to-cure diseases, for whom conventional therapies often lack an effective solution. Notwithstanding the recent approval of various nanoparticles (NPs) therapies and their potential, one of the main limitations still relies in the upscale of NPs production, which most of the time remains a laboratory product. Based on promising former results obtained from the NanotechLab with cholesterol-based, brain-targeted NPs applied to the treatment of Huntington’s Disease (HD), this study aims at improving the production from a lab-scale to an industrial technique. HD is a genetic disease linked to a defective production of a protein called huntingtin (HTT), and recent studies revealed that a lowered cholesterol (CHOL) synthesis in the brain is also involved, concurring to neuronal degeneration. CHOL delivery to the brain using NPs was already proven beneficial to restore cognitive and motor impairment in HD models, but the optimized NP suffers from scalability issues. In this perspective, this study wants to investigate the use of an industrial method for NP preparation, i.e. the microfluidic technique, for the formulation of CHOL NPs. Moreover, since gene therapy holds an incredible potential for genetic diseases such as HD, the second aim of this project is to optimize CHOL NPs loaded with an siRNA, to achieve a dual therapeutic approach: while siRNA will lower the production of mutant HTT, the single-component composition will help restore physiological concentrations of CHOL in damaged neurons. In a first instance, a screening study was conducted using a syringe pump to properly investigate how operative parameters impacted on the formation of NPs, and to identify optimal compositions in terms of flow rate ratios, CHOL and surfactant amounts, aiming at maximizing CHOL’s concentration in the final product to deliver the highest dosage to the brain. Hereafter, with a view to encapsulating genetic material, additional studies were done to implement a synthetic, cationic derivative of CHOL (DC-CHOL) in the formulation. Encapsulation experiments were carried out with a negative control siRNA to determine if the method was suitable for the purpose. Once the most promising candidates had been identified, the method was translated to an Automated NanoParticle system qualified for industrial-scale production: an additional screening study was performed to further optimize the method for a fully scalable production. All NPs produced were characterized in terms of size, polydispersity index, zeta potential, and storage stability at 4°C and -20°C (with and without cryoprotectants), while morphological and weight yield analyses were conducted on best performing candidates. Encapsulation efficiency was also determined for NPs assembled with the two instruments, confronting and analyzing the impact of both of them on the encapsulation of genetic material. While being yet another demonstration of nanomedicine’s potential in designing innovative therapeutic approaches, and demonstrating microfluidic’s utility for the industrial-scale production of NPs, this study is a more than promising starting point for the production of NPs as vectors for targeted gene therapy against HD, offering a novel strategy to treat this pathology. Further studies will concern in vitro and in vivo studies with a specific therapeutic siRNA, hopefully leading to the production of an efficient nanoformulation for HD.