Riassunto analitico
Il miglioramento genetico dei lieviti enologici è un processo senza fine che comporta il continuo sviluppo di nuovi starters. Secondo lo specifico campo di applicazione, gli operatori possono essere interessati a diversi tratti di interesse. Questi possono comprendere aspetti come la resistenza a condizioni fermentative avverse e la produzione o rilascio di specifici metaboliti che hanno effetto sia sul colore che sull'aroma del prodotto finale. Il presente progetto riguarda il miglioramento di lieviti enologici per quattro diversi tratti di interesse. Il progetto ha compreso: la costruzione di incroci intraspecifici di Saccharomyces cerevisiae con migliorata resistenza alla carenza di Azoto (I); l'ottenimento di ceppi di S. cerevisiae caratterizzati da alta produzione di Glutatione (GSH) e performance fermentativa (II); l'applicazione di una strategia di evoluzione adattativa mirata all'ottenimento di ceppi Rame-resistenti di S. cerevisiae e S. uvarum (III); la ricerca di ceppi di S. cerevisiae e S. uvarum dotati di attività β-Glucosidasica. Nel primo progetto (I), una progenie randomizzata di S. cerevisiae è stata ottenuta a partire dall'incrocio intra-specifico tra ceppi commerciali. L'applicazione della progenie a fermentazioni in scala da laboratorio con un basso contenuto di APA (Azoto Prontamente Assimilabile) ha selezionato un ceppo, i.e. UMCC 2592, che meglio risponde alle condizioni fermentative avverse rispetto ai ceppi parentali. Nel secondo progetto (II), una selezione iterativa è stata operata sulla progenie monosporale del ceppo UMCC 855 (=21T2); più in particolare, ci siamo focalizzati sui cloni monosporali Molibdato-resistenti, poiché è più probabile che essi presentino anche una alta produzione di GSH. Abbiamo progressivamente eliminato i ceppi non adatti applicando una selezione basata sulla resistenza a 15 mM di Ammonio Molibdato in terreno ricco, sulla bontà del profilo fermentativo e sulla produzione di GSH. Un ceppo, i.e. 21T2-D58, è stato selezionato per lo scale-up industriale, poiché presentava un comportamento competitivo sia per quanto riguarda la performance fermentativa che per la produzione di GSH. Nel terzo progetto (III) abbiamo applicato due differenti condizioni selettive basate sulla concentrazione di Solfato di Rame e sulla temperatura di incubazione a una popolazione randomizzata ottenuta dai ceppi UMCC 2575 (S. uvarum) e UMCC 2592 (S. cerevisiae). Tre ceppi, tutti appartenenti a S. cerevisiae sono stati ottenuti a partire dalla prova condotta a 37°C con 190 mg/L di Solfato di Rame. I tre ceppi sono stati applicati a fermentazioni in scala da laboratorio in presenza di concentrazioni tecnologiche di Rame (i.e. 40 mg/L). Tutti e tre i ceppi hanno mostrato un comportamento fermentativo migliorato rispetto al ceppo parentale UMCC 2592, dimostrandosi quindi buoni candidati per l'ulteriore analisi e, possibilmente, per lo scale-up del processo fermentativo. Il quarto progetto (IV) è stato lo screening dell'attività β-Glucosidasica in un set di 79 ceppi di S. cerevisiae e S. uvarum isolati da mosto crioconservato. Lo screening è stato effettuato sia attraverso l’analisi qualitativa (screening con substrati cromogenici) che quantitativa (saggio spettrofotometrico). Il test qualitativo ha riscontrato un’alta percentuale di positività per il subset di ceppi appartenenti a S. uvarum (11 ceppi) rispetto a quello di S. cerevisiae (2 ceppi). Inoltre, i ceppi di S. uvarum hanno mostrato una maggiore attività se valutati col test quantitativo. I ceppi saranno testati in fermentazioni in scala da laboratorio per determinarne l'attitudine enologica. La ricerca mostra che S. uvarum potrebbe costituire terreno fertile per il recupero di ceppi con attività β-Glucosidasica da includere nei futuri programmi di breeding.
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Abstract
The genetic improvement of winemaking yeasts is a never-ending process, which entails a continuous development effort. According to the specific field of application, the operators might be interested in different traits. These may comprise aspects such as the resistance to harsh fermentative conditions and the production or release of specific metabolites affecting both the colour and the aroma of the final product. The present project deals with the improvement of winemaking yeasts for four different traits of interest. The project comprised: the construction of intra-species crosses of Saccharomyces cerevisiae improved for the resistance to Nitrogen deficiency (I); the obtainment of S. cerevisiae strains characterized by high Glutathione (GSH) production and fermentative performance (II); the application of an adaptive-evolution strategy aimed at recovering Copper-resistant strains of S. cerevisiae and S. uvarum (III); the search for strains belonging to both S. cerevisiae and S. uvarum with β-Glucosidase activity (IV). In the first project (I), a randomized progeny of S. cerevisiae was obtained starting from intra-species crosses between commercial strains. The application of the progeny to lab-scale fermentations with a low level of YAN (Yeast Available Nitrogen) selected a strain, i.e. strain UMCC 2592, which better responded to adverse metabolic conditions compared to the two parental strains. In the second project (II) recursive selection steps were operated on the monosporic progeny of the strain UMCC 855 (=21T2); more in particular, we focused on the Molybdate-resistant monosporic clones, since they are more likely to feature high GSH production. We progressively phased out all the unfit strains by applying a selection based on the resistance to 15 mM Ammonium Molybdate in rich medium, on the goodness of the fermentative profile and on the production of GSH. A strain, i.e. 21T2-D58, was selected for the industrial scale-up as it featured a competitive behaviour concerning both fermentative kinetics and production of GSH. In the third project (III) we applied two different selective conditions, based on the concentration of Copper Sulfate and on the incubation temperature, to a randomized population obtained from UMCC 2575 (S. uvarum) and UMCC 2592 (S. cerevisiae). Three strains, all belonging to S. cerevisiae, were isolated from the adaptive evolution trial performed at 37°C with 35 mg/L Copper. The three strains were applied to lab-scale fermentations in the presence of technological concentration of Copper (i.e. 26 mg/L). All three strains showed improved fermentative behaviour compared to the parental strain UMCC 2592, thus proving to be good candidates for further investigation and, possibly, for the scale-up of the fermentative process. The fourth project (IV) was the screening of β-Glucosidase activity in a set of 79 strains of S. cerevisiae and S. uvarum isolated from cryopreserved must. The screening was performed through both qualitative (screening with chromogenic substrates) and quantitative (spectrophotometric assay) analyses. The qualitative test found a greater percentage of positivity for the subset of strains belonging to S. uvarum (11 strains), compared to S. cerevisiae (2 strains). In addition, the strains of S. uvarum showed a greater activity when evaluated with the quantitative assay. The strains will be tested in lab-scale fermentations to assess their winemaking aptitude. More importantly, the research shows that S. uvarum might prove a fertile field for the retrieval of novel β-Glucosidasic strains to be included in the future breeding programs.
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