Riassunto analitico
Il levano è un biopolimero appartenente alla famiglia dei fruttani, un tipo di esopolisaccaride prodotto da alcune specie di piante, funghi e batteri. Il levano microbico è composto da residui di fruttosio uniti da legami β(2-->6) ed è sintetizzato attraverso l’enzima levansucrasi (E.C.2.4.1.10), che catalizza l’attività idrolitica e di transfruttosilazione utilizzando saccarosio come substrato. Il levano microbico consente numerose applicazioni grazie alla sua facilità di estrazione, alla produzione controllata e alle caratteristiche fisico-chimiche. Per la sua elevata stabilità, solubilità, capacità di legare acqua, bassa viscosità esso viene utilizzato negli alimenti come stabilizzante o sostituto dei grassi, come prebiotico, nell’industria dei cosmetici e in medicina per le sue proprietà antiossidanti, antinfiammatorie e antitumorali. I batteri acetici sono dei gram-negativi, aerobi obbligati in grado di produrre numerosi esopolisaccaridi quali cellulosa, levano ed eteropolisaccaridi. Molti ceppi sono conosciuti per la loro capacità di produrre levano da saccarosio e la sintesi è influenzata da fattori quali la specie e le condizioni di coltivazione, tra cui la temperatura, il pH, la concentrazione di ossigeno e il terreno utilizzato. In particolare la concentrazione di saccarosio e la velocità di agitazione giocano un ruolo molto importante nella definizione delle caratteristiche del levano. Infatti in presenza di un eccesso di saccarosio vengono prodotte più catene, e l’alta velocità di agitazione permette un maggiore contatto fra l’enzima e il substrato. In questo studio abbiamo testato l’effetto di un’alta concentrazione di saccarosio e di velocità di agitazione sulla produzione di levano per 12 ceppi di batteri acetici appartenenti a cinque differenti generi (Neoasaia, Kozakia, Gluconobacter, Komagataeibacter e Acetobacter). La produzione di levano è stata testata in terreno HS-S contenente saccarosio, usando una concentrazione di 250 g/L. Il test è stato condotto per 48 e 96 ore a 30°C e 200 rpm. I campioni sono stati raccolti e sottoposti ad analisi per valutare la produzione di levano, il pH, l’acidità titolabile, gli zuccheri residui (glucosio, fruttosio, saccarosio) e acido gluconico. La produzione di cellulosa è stata valutata qualitativamente e quantitativamente utilizzando il terreno HS-G contenente glucosio (2% p/v). I nostri risultati sono stati quindi confrontati con quelli ottenuti in uno studio precedente, dove sono stati utilizzati 70 g/L di saccarosio e 140 rpm. In Neoasaia chiangmaiensis NBRC 101099T abbiamo riscontrato un elevato consumo di saccarosio. Nelle prime 48 ore circa il 66% dello zucchero è stato consumato, risultando in una elevata quantità di levano (43,5 g/100g ± 5,4) e di acido gluconico (3,85 g/L ± 0,6). Alle condizioni utilizzate nel precedente studio (70 g/L; 140 rpm) lo stesso ceppo ha mostrato una produzione di levano molto più bassa. Da Komagataeibacter xylinus K2G30, conosciuto come un produttore di cellulosa, abbiamo ottenuto un buon quantitativo sia di cellulosa sia di levano utilizzando terreni contenenti rispettivamente glucosio e saccarosio. I risultati ottenuti nel nostro esperimento hanno confermato che la resa di produzione di levano è strettamente dipendente da parametri quali la quantità di saccarosio, la specie microbica e la velocità di agitazione. L’utilizzo di una elevata concentrazione di saccarosio e di un’elevata velocità (200 g/L; 200 rpm) ha permesso una grande variabilità nella produzione di levano da parte di alcuni dei ceppi testati. Tali risultati possono rappresentare la base per ulteriori studi, che permetteranno di capire il comportamento dei singoli ceppi e selezionare quelli capaci di produrre elevate quantità di levano, utilizzabili nell'ambito del food e del non-food.
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Abstract
Levan is a biopolymer belonging to the family of fructans, a type of exopolysaccharide produced by some plants, fungi, and bacteria. Microbial levan is composed of fructose residues linked by β(2-->6) bonds which is synthesized through the enzyme levansucrase (E.C.2.4.1.10), that catalyses hydrolytic and transfructosylation activity by using sucrose as a substrate. Compared to plant-derived levan, microbial levan provides wider applications due to its ease of extraction, controlled production and better physiochemical properties. Because of its high stability, solubility, water holding capacity and low viscosity, microbial levan is used in food (stabilizer, fat substitute), feed (prebiotics), cosmetics (whitener, moisturizer), and medicine (anti-oxidant, anti-inflammatory, anti-cancer activities) applications.
Acetic acid bacteria are strict aerobic, gram-negative bacteria, which produce extracellular homopolysaccharides such as cellulose, levan and acetan-based heteropolysaccharides. Several strains are already known to produce levan extracellularly in sucrose based environment, but the production is influenced by many factors such as the bacterial species and culture conditions, like temperature, pH, oxygen concentration and culture medium. Mainly, sucrose concentration and agitation speed show impact on characterization of levan where, in presence of excess sucrose, more levan chains are formed and high agitation increases the effective contact between enzyme and substrate.
In this study, the effect of high sucrose concentration and agitation speed on levan production was tested on 12 acetic acid bacteria strains belonging to the genera Neoasaia, Kozakia, Gluconobacter, Komagataeibacter, Acetobacter. Levan production was performed in HS-sucrose medium at 250 g/L of sucrose. The tests were conducted for 48 and 96 h at 30 ºC, at 200 rpm. Samples were collected and subjected to analyse levan production, pH, titratable acidity, residual sugars (glucose, fructose, sucrose), and gluconic acid using enzymatic kits. Cellulose production was qualitatively and quantitatively tested in HS-glucose medium (2% w/v). Our results were then compared with the ones obtained in our previous study, where 70 g/L of sucrose (HS-sucrose) was used to cultivate at 140 rpm.
Consumption of sucrose is remarkable in N. chiangmaiensis NBRC 101099T in the first 48 h, where almost 66% of the initial carbon source was consumed, producing high yield of levan (43.5 g/100g ± 5.4) and gluconic acid (3.85 g/L ± 0.6). Komagataeibacter xylinus K2G30 which is known as cellulose producer, showed good amount of cellulose and levan yield in glucose and sucrose medium respectively.
Results obtained in our experiment confirmed that levan production yield is strictly affected by parameters such as sucrose concentration, bacterial species and the agitation speed. High sucrose concentration and agitation speed (250 g/L; 200 rpm) permit a greater variability in the production of levan by some tested strains. These results can represent the base for further studies, to understand the behavior of individual strains and selection of high levan producers that can be utilized in food and non-food industry.
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