Riassunto analitico
In questo studio è mostrata la caratterizzazione di cloni HeLa esprimenti una proteina umana mutata (Rodopsina) e la progettazione di TALE-nucleasi (TALEN) per ottenere un silenziamento Rodopsina-specifico.
La Rodopsina (RHO) è una proteina recettoriale luce-sensibile. E’ il principale pigmento biologico nei bastoncelli della retina. Consiste nel gruppo funzionale opsina legato reversibilmente ad un cofattore, il retinale. Essa è anche membro della famiglia dei recettori accoppiati alle proteine G (GPCRs) e l’iniziatore della cascata visiva, un processo dove un protone di luce visibile è convertito in un segnale neuronale che eventualmente sarà percepito come fenomeno visivo. Mutazioni nella Rodopsina umana possono influenzare la sua struttura, il suo traffico o la sua attività. Inoltre possono portare ad una serie di malattie ereditarie chiamate Retinite Pigmentosa (RP), dei disordini neurodegenerativi progressivi dei fotorecettori che causano perdita della vista notturna, distinzione dei colori e una complessiva cecità. La mutazione di nostro interesse colpisce un singolo nucleotide nel codone 23, con la sostituzione da una Prolina a un’Istidina (Pro23His/P23H). Diversamente dalla Rodopsina wild-type, glicosilata e trasportata nella membrana plasmatica, la mutazione missenso P23H causa un accumulo di proteina non ripiegata nel reticolo endoplasmatico (RE), inducendo un severo stress cellulare, l’attivazione della risposta cellulare, portando ad una degenerazione dei fotorecettori e causando una forma di Retinite Pigmentosa autosomica dominante.
I cloni HeLa sono stati ottenuti attraverso vettori lentivirali (LV) contenenti il DNA codificante (cDNA) per la Rodopsina mutata. Abbiamo definito il numero di copie di LV integrate nel genoma delle cellule attraverso TaqMan PCR e analisi di Southern Blot. Abbiamo correlato il numero di copie con l’espressione della Rodopsina, così da selezionare i cloni appropriati per studiare gli effetti di un knock down genico attraverso trasfezione di TALEN. Le nucleasi TALE, ottenute dalle proteine batteriche dello Xantomonas, sono capaci di riconoscere, legare e tagliare una specifica sequenza di DNA. La rottura a doppio filamento ottenuta sarà riparata dalla via non-homologous end joining (NHEJ), che riunisce le estremità del DNA in modo casuale, andando ad inserire inserzioni o delezione nel punto di rottura. Questi cambiamenti causano un’alterazione nel frame di lettura, generando proteine troncate o inattive.
Dopo la trasfezione abbiamo verificato l’efficienza del taglio TALE-mediato sul cDNA della Rodopsina P23H mediante analisi Cel-1. Infine analisi di PCR quantitativa (20ggdi) sull’espressione del gene Rho in cellule trattate e non trattate ha mostrato una sostanziale riduzione dell’espressione di RHO P23H.
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