Riassunto analitico
Il trattamento delle malattie del sistema nervoso centrale (SNC) rappresenta una delle sfide più impegnative in campo medico. Sebbene molti farmaci abbiano mostrato potenziali effetti curativi verso queste patologie, esistono ancora ostacoli da oltrepassare. Primo tra tutti la barriera ematoencefalica (BEE), che limita l’ingresso di farmaci nel cervello. In quest’ottica, le nanomedicine, quali le nanoparticelle (NP), consentono di veicolare principi attivi e possono garantire, in seguito a modificazione superficiale con appositi ligandi, l’attraversamento della BEE e la penetrazione nel cervello. In diversi studi, la modificazione della superficie di NP con ligandi in grado di direzionare al cervello ha mostrato risultati promettenti.
In questo lavoro sono state formulate, mediante nanoprecipitazione, NP di colesterolo (Chol), un lipide fisiologico e biocompatibile, modificate con tre nuovi ligandi (L1, L2, L3) potenzialmente in grado di direzionare le NP al cervello: sono state così ottenute tre diverse formulazioni di NP lipidiche direzionate al SNC (C-L1, C-L2 e C-L3).
Inizialmente, è stato ottimizzato un metodo HPLC per quantificare il ligando incorporato nella matrice delle NP C-L1, C-L2 e C-L3. Un’ottimizzazione del protocollo formulativo è stata poi eseguita variando alcuni parametri, quali il solvente organico, il quantitativo di ligando aggiunto in formulazione e il metodo di purificazione, per ottenere NP con proprietà chimico-fisiche e tecnologiche idonee alla somministrazione sistemica. Le NP sono poi state caratterizzate in termini di: 1) proprietà chimico-fisiche, quali la dimensione, la distribuzione dimensionale (espressa tramite l’indice di polidispersione, PDI), la carica superficiale (espressa tramite il potenziale zeta), la morfologia e la stabilità alla conservazione e 2) proprietà tecnologiche, quali la resa ponderale, la composizione e il recupero di ligando e Chol e la composizione di tensioattivo residuo.
Le NP C-L1, C-L2 e C-L3 hanno mostrato, prima e dopo purificazione, dimensioni <300nm e PDI <0.3, ossia proprietà compatibili con una somministrazione sistemica. Le NP C-L1 e C-L3 hanno inoltre mostrato stabilità alla conservazione sia a 25°C sia a 4°C per due settimane. Mentre la caratterizzazione delle NP C-L1 e C-L3 è stata conclusa con successo, la caratterizzazione delle NP C-L2 ha evidenziato un cambiamento, probabilmente collegato alla struttura chimica del ligando L2, che ha causato incongruenze nei cromatogrammi HPLC. Pertanto, sono in corso approfondimenti per completare la caratterizzazione delle NP C-L2. In seguito ai risultati promettenti ottenuti sulle NP C-L1 e C-L3, si è scelto di eseguire uno studio di caricamento di un farmaco sulle NP C-L1. Un coniugato ibuprofene-paracetamolo (IP), precedentemente studiato dal gruppo Te.Far.T.I. e collaboratori per la potenziale attività antinfiammatoria e per il rilascio controllato, è stato scelto come farmaco modello. Si è notato come il caricamento di IP nelle NP non abbia avuto impatto negativo su dimensione e PDI, permettendo così di ottenere NP caricate con IP paragonabili alle NP prive di farmaco. Inoltre, sono stati determinati l’efficienza di incapsulazione (EE) e il contenuto (LC) di IP nelle NP C-L1: l’incapsulazione è avvenuta con successo, ma i valori di EE e LC sono risultati significativamente bassi e variabili (EE=6.6%±3.3%; LC= 0.9%±0.3%).
Questo lavoro apre la strada ad ulteriori studi in vivo, che sono attualmente in corso in collaborazione con l’Università di Milano, per capire se le NP modificate con i ligandi siano in grado di attraversare la BEE. Studi preliminari hanno mostrato risultati promettenti che orientano verso studi futuri di veicolazione di farmaci al cervello con l’utilizzo di NP modificate con i ligandi L1, L2 e L3.
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Abstract
Treating Central Nervous System (CNS) disorders represents one of the most hampering challenges in the medical field. Even though many drugs have been shown to have potential curative effects against these diseases, there are still obstacles to overcome. Above all, lies the Blood-Brain Barrier (BBB) which hinders the entrance of drugs into the brain. In this view, nanomedicines, such as nanoparticles (NPs), which can improve the characteristics of pharmaceuticals, represent a powerful tool to deliver therapeutics. Moreover, these delivery systems add the possibility for surface-engineering with ligands that can enable BBB crossing and penetration into the brain. In many works, the surface modification of NPs with brain targeting ligands has shown promising results.
In this work, lipid-based NPs composed of cholesterol (Chol), a physiological and biocompatible lipid, were formulated by nanoprecipitation. Therefore, three novel potential brain-targeting ligands (L1, L2, L3) were incorporated into NPs, allowing the formation of three different brain-targeted lipid-based NPs: C-L1, C-L2, and C-L3 NPs. First, a HPLC quantification method for L1, L2 and L3 was optimized to quantify the amount of ligand incorporated into the NP matrix. Then, an optimization of the formulative protocol was performed by varying some formulative parameters, such as organic solvent, amount of ligand used in the formulation, and purification method, to obtain NPs with physico-chemical and technological properties suitable with systemic administration. Thus, NPs were characterized in terms of: 1) physico-chemical properties, such as size, size distribution (expressed through the polydispersity index, PDI), surface charge (expressed through the zeta potential), morphology, and storage stability, and 2) technological properties, such as weight yield, ligand composition and recovery, and the composition of Chol and residual surfactant in the NPs. C-L1, C-L2 and C-L3 NPs showed a particle size <300nm and a PDI <0.3 before and after purification, showing suitability for systemic injection. C-L1 and C-L3 NPs also showed stability to storage at 25°C and at 4°C over two weeks. While characterization of C-L1 and C-L3 NPs was successful, artifacts, probably linked to the chemical structure of L2, which led to inconsistencies during its characterization by HPLC, were found. For this reason, ongoing optimizations for the technological characterization of C-L2 NPs must be further investigated outside of the framework of this thesis work and are already underway. Due to the promising results obtained for C-L1 and C-L3 NPs, C-L1 NPs were chosen to perform a drug loading study. An ibuprofen and paracetamol conjugate (IP), previously studied by the Te.Far.T.I. group and partners for its potential anti-inflammatory activity and controllable release, was chosen as a model drug. It was demonstrated that the addition of IP had no negative impact on both size and PDI of NPs, allowing to obtain IP-loaded NPs comparable with the above cited unloaded NPs. Furthermore, IP-loaded C-L1 NPs were characterized in terms of IP encapsulation efficiency (EE) and loading content (LC). The encapsulation of IP was successful, but, unfortunately, both the EE and the LC were found to be significantly low and accompanied by high percent standard deviations (EE = 6.6% ± 3.3%; LC = 0.9% ± 0.3%).
This work paves the way for further in vivo studies, which are currently being performed in partnership with the University of Milan, to understand if ligand-modified NPs can cross the BBB. Preliminary studies have shown interesting and promising results that promote the need for future studies of drug delivery to the brain using NPs modified with the targeting ligands L1, L2 and L3.
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