Riassunto analitico
La timidilato sintasi umana (hTS) è un enzima omodimerico chiave nella biosintesi del DNA; catalizza la metilazione riduttiva del 2’-desossiuridina-5’-monofosfato (dUMP) a 2’-desossitimidina-5’-monofosfato (dTMP), utilizzando il metilentetraidrofolato come cofattore. La TS è uno dei principali target nella chemioterapia del cancro colo-rettale e di altre forme di neoplasie, tra cui il carcinoma ovarico. Il suddetto enzima si presenta in forma dimerica, dotata di attività catalitica, e monomerica, capace di legare vari mRNA, compreso il proprio, controllando così i livelli di espressione della proteina attraverso una modulazione dell’efficienza traduzionale. Questo meccanismo di autoregolazione sembra sia coinvolto nel problema della farmaco-resistenza: gli inibitori attualmente in clinica, avendo struttura analoga ai substrati naturali dell’enzima, legano e stabilizzano la forma dimerica, impedendo al monomero di svolgere la sua attività regolatoria con conseguente sovraespressione della TS. Studi strutturali dell’enzima hanno evidenziato l’esistenza di due conformeri dell’hTS, uno definito “active form”, nel quale il loop 181-197 è posizionato a livello del sito catalitico ponendo la Cys 195 in posizione ideale per la catalisi, l’altro “inactive form” nel quale il loop ruotando di 180° allontana dal sito attivo la cisteina catalitica. Tale variabilità conformazionale, specifica della TS umana, ha dato lo spunto per progetti di ricerca che mirano a sviluppare inibitori dell’hTS in grado di stabilizzarne la conformazione inattiva, inibendone quindi l’attività catalitica, senza determinarne una sovraespressione. Nell’ultima fase del progetto LIGHTS (LIGand to Interfere with Human TS, VI EFP) sono stati sviluppati una serie di peptidi che inibiscono l’hTS tramite un meccanismo di legame ad un sito di binding allosterico posto all’interfaccia fra i due monomeri nella conformazione di-inattiva dell’enzima.
In questo lavoro di tesi diverse tecniche spettroscopiche, in particolare fluorimetriche, sono state utilizzate per indagare i meccanismi di conversione fra le due conformazioni della proteina, per caratterizzare l’interazione del nostro candidato farmaco octapeptidico “LR” con l’hTS e verificare se il legame di LR influenza il peso relativo delle due conformazioni della proteina e la velocità di interscambio active ↔ inactive. Per l’indagine della dinamica conformazionale sono state effettuate misure di fluorescenza intrinseca della proteina, sia stazionarie sia risolte nel tempo, e cinetiche di evoluzione dei segnali osservati per effetto della variazione di concentrazione di ioni fosfato e del substrato dUMP. Esperimenti basati sul trasferimento di energia fra un fluoroforo
donatore ed un fluoroforo accettore (FRET) hanno invece fornito informazioni quantitative accurate sull’equilibrio di legame di LR sia ad hTS ricombinante in soluzione tampone, sia ad hTS espressa direttamente in cellule tumorali umane modello.
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