Riassunto analitico
I Cell-Penetrating Peptides (CPPs) sono una classe di peptidi composti da 5-30 amminoacidi capaci di attraversare la membrane plasmatica.
I CPPs possono essere utilizzate al fine di indirizzare e rilasciare le molecole biologicamente attive (siRNA, DNA, peptidi) attraverso la membrana plasmatica che risulta impermeabile al loro accesso, per il perseguimento di differenti obiettivi terapeutici (i.e. antimicrobici) e differenti utilizzi ad esempio come carrier di peptidi e proteine nel trattamento di tumori o di malattie infiammatorie.
Studi precedentemente svolti sull’interazione dei CPPs con le cellule hanno dimostrato che essi possono indurre un’ampia gamma di effetti collaterali correlati al meccanismo di accesso ed alla loro attività all’interno delle cellule stesse.
Uno dei primi CPPs realizzati è di natura cationica, derivante dalla proteina Tat di HIV-1(la cui sequenza amminoacidica è RKKRRQRRR). Studi su peptidi composti da arginina (da R3 a R12) hanno mostrato che la minima sequenza necessaria per l’uptake cellulare è una octaarginina (R8) e che all’aumento del numero di arginine aumenta anche il livello di accesso all’interno della cellula.
I CPPs possono entrare nella cellula mediante differenti modalità: per endocitosi e per diretta traslocazione attraverso la membrana plasmatica. Quest’ultimo meccanismo è caratterizzato da rapido rilascio del CPP nel citosol ed avviene come conseguenza dell’attivazione di una specifica via di trasduzione del segnale.
E’ stato dimostrato che la via endocitica difficilmente permette di raggiungere concentrazioni sufficienti nel citosol a causa dei processi proteolitici di degradazione. Dunque, per molti CPPs, l’unica chance al fine di assolvere alla funzione terapeutica è quella di sfruttare come principale via di ingresso l’uptake diretto.
E’ stato osservato che l’uptake diretto ha inizio in una ristretta zona della membrana plasmatica determinando un rapido rilascio del peptide nel citosol e preservando l’integrità di membrana. Queste efficienti piattaforme di internalizzazione sono chiamate Nucleation Zones (NZ) e sono caratterizzate da un arricchimento in ceramide.
Se da una parte l’uptake via endocitosi è noto in dettaglio, la via di segnalazione coinvolta nell’uptake diretto via NZ non è ancora stata chiarita ed è su questo che si incentra la tesi da me svolta.
Studi precedenti suggeriscono un coinvolgimento dell’enzima Sfingomielinasi Acida (ASMase) nella formazione dei domini di membrana arricchiti in ceramide: l’ipotesi è che vi sia un‘iniziale induzione dell’ASMase a traslocare attraverso la membrana, seguita da un rimodellamento della membrana stessa mediante formazione di NZ e conseguente ingresso di CPPs nel citosol.
Dunque, sulla base di queste evidenze, è stata ideata un’ipotetica via di segnalazione coinvolta nell’uptake delle CPPs mediante la formazione delle NZ.
Al fine di esplorare nel dettaglio il meccanismo di trasduzione coinvolto nell’uptake diretto di CPPs, sono stati utilizzati inibitori farmacologici che potessero interferire con il sistema biologico a differenti livelli. E’ stato inizialmente utilizzato l’inibitore della Diacilglicerolo-chinasi, il quale è coinvolto nei meccanismi di trasduzione a monte dell’enzima ASMase. Successivamente sono stati utilizzati Imipramine e Desipramine come inibitori funzionali dell’enzima ASMase. Al fine di dimostrare il coinvolgimento di specifici enzimi e reazioni nella via di segnalazione, le variazioni nell’uptake di CPPs marcati con fluoresceina sono state monitorate mediante esperimenti di citofluorimetria a flusso e microscopia confocale. Inoltre la sovraespressione della proteina ricombinante mCherryASMase Wild Type e Mutante e il suo studio mediante Microscopia Confocale e Fluorescence Correlation Spectroscopy (FCS) ha permesso di verificare il coinvolgimento dell’enzima ASMase nel meccanismo di uptake diretto delle CPPs.
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Abstract
Cell-penetrating peptides (CPPs) are a class of peptides composed by 5-30 aminoacids, able to cross the plasma membrane; they represent a potential drug-delivery system for membrane-impermeable active molecules since they can be used to target and deliver CPP complexes in the human body and they can also incorporate functional motifs.
Although the uptake by endocyotsis is well characterized, the signaling pathway beyond the direct uptake by Nucleation Zone (NZ) formation is still not clear. Previous studies suggested an involvement of Acid Sphingomyelinase (ASMase) enzyme in the formation of ceramide-enriched membrane domains.
Based on these pieces of evidence, an hypothetical signaling pathways involved in the CPP uptake by NZ was conceived. Then using pharmacological inhibitors -such as Diacylglycerol Kinase Inhibitor (DGKi), imipramine and desipramine- and overexpressing recombinant protein – such as mCherryASmase Wild Type / Mutant – interferences with the signaling pathway are obtained. Thereby variations in CPP uptake were monitored in order to prove the involvement of such enzymes, lipids and molecules in the pathway.
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