Riassunto analitico
La Retinite pigmentosa (RP) è una malattia genetica altamente eterogenea. Clinicamente si manifesta come una progressiva perdita della visione con una riduzione del campo visivo periferico che nella sua fase terminale può portare alla completa cecità. Le cause della malattia possono essere ricondotte a diverse mutazioni in svariati geni, circa 50, che interessano principalmente i fotorecettori, cellule nervose sensibili alla luce, presenti nella retina. In particolare, nei pazienti con RP si osserva prima la degenerazione dei bastoncelli, cellule responsabile della visione notturna, e successivamente dei coni, cellule responsabile della visione diurna. Non esistono attualmente cure che permettano una reversione della malattia o un suo rallentamento. Negli anni sono stati fatti moltissimi studi riguardanti le pathway di morte dei bastoncelli e questi hanno portato alla comprensione dei meccanismi che vengono innescati dai diversi tipi di mutazione, ma spesso nei pazienti la malattia viene diagnosticata quando ormai la maggior parte dei bastoncelli sono già morti poiché i sintomi iniziali possono essere confusi con un normale disturbo della vista. Recentemente, quindi, sono stati intrapresi anche studi riguardanti i coni, ovvero la popolazione di fotorecettori che è maggiormente presente al momento della diagnosi e la cui sopravvivenza sarebbe sufficiente al paziente per mantenere l’indipendenza e non necessitare di assistenza sociale. Lo scopo della mia tesi è stato lo studio dei difetti nei coni in retine affette da RP. Inizialmente ho caratterizzato il picco di morte di tale popolazione su un modello murino knock-out di Rodopsina, Rho -/-, proteina coinvolta nella fototrasduzione. Per tale studio ho usato anticorpi diretti contro le opsine dei coni analizzando sezioni di retina a diversi tempi dopo la nascita per individuare l’eventuale variazione del numero di coni. Ho osservato una diminuzione delle cellule positive alle opsine dei coni a partire dal cinquantesimo giorno dopo la nascita, P50, con un picco della morte a P65 e quasi la completa scomparsa a P90. Questa analisi è stata importante per capire che la morte dei coni si sovrappone solo parzialmente alla morte dei bastoncelli, il cui picco apoptotico appare a P45, come dimostrato in precedenza nel nostro laboratorio. La tappa successiva è stata quella di capire quale fosse la pathway di morte che interessava i coni. Poiché la morte dei bastoncelli avviene mediante la frammentazione della cromatina si è iniziata l’analisi con lo studio dell’apoptosi tramite metodo TUNEL. Ciononostante non ho mai rilevato cellule che esprimevano opsine dei coni positive al TUNEL. Abbiamo quindi ipotizzato che la morte dei coni avviene per meccanismi non apoptotici. Successivamente, sulla base di studi sui coni condotti su un diverso modello animale (Murakami et al., 2012), ci si è focalizzati sulla necroptosi. In questa via RIP1 e RIP3 sono le proteine maggiormente coinvolte, pertanto sono stati fatti studi per valutare variazioni di espressione di queste molecole tramite Real Time qPCR e Western Blot. Anche in questo caso non si è potuta correlare la morte dei coni con la necroptosi. Infine si è presa in considerazione l’autofagia. In particolare si è studiato la macroautofagia andando a ricercare la presenza di LC3 sia a livello di proteina che mRNA. La comprensione di queste informazioni preliminari sulle pathway attive durante la morte dei fotorecettori sono il primo passo su cui basare successivamente studi sugli stimoli che li conducono a morte; questi quindi potrebbero diventare bersaglio terapeutico per una possibile cura che rallenti o, ancora meglio, blocchi la progressione della malattia per non renderla completamente invalidante.
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