Riassunto analitico
Le cellule tumorali sviluppano frequentemente dei meccanismi di adattamento che permettono loro la sopravvivenza in ambienti poveri di ossigeno e nutrienti, e per questo necessitano di mitocondri funzionanti. Questo microambiente, ricco di fonti di stress, può facilitare la produzione di specie reattive dell’ossigeno (ROS) che rappresentano una sorgente di danno sia per le proteine che per il DNA mitocondriali. Per questo motivo, un efficiente eliminazione delle proteine danneggiate è cruciale per prevenire questo processo nocivo. Lon è una proteasi mitocondriale ATP-dipendente, codificata a livello nucleare, che degrada proteine danneggiate, assiste il folding proteico e partecipa al mantenimento dei livelli del DNA mitocondriale (mtDNA). L’espressione di Lon è aumentata in alcuni tipi di cancro, e questo aumento sembra essere utile per la proliferazione delle cellule tumorali e il loro adattamento a condizioni di stress (ad esempio ipossia). La diminuzione dell’espressione di Lon, invece, induce un aumento della morte cellulare, probabilmente a causa dell’accumulo di aggregati proteici nei mitocondri che non permettono un corretto funzionamento dell’organello. Lo scopo dello studio è stato quello di caratterizzare le alterazioni mitocondriali nella linea cellulare RKO di cancro al colon a seguito del silenziamento di Lon, e di mettere a punto un modello in vitro per valutare la funzionalità di Lon stessa. L’RNA messaggero di Lon è stato silenziato tramite interferenza ad RNA, utilizzando un vettore per l’espressione inducibile (regolata dalla doxiciclina) di uno short hairpin RNA; è stata così ottenuta una riduzione dell’espressione del 71.0±8.5%. I mitocondri delle cellule silenziate mostrano bassi livelli di trascritti mitocondriali, ridotti livelli di alcune subunità dei complessi della fosforilazione ossidativa (in particolare del complesso I), una marcata riduzione del consumo di ossigeno e una alterazione nella sintesi di ATP. E’ stato osservato anche un aumento dei livelli sia di anione superossido mitocondriale che di perossido di idrogeno. All’analisi tramite microscopia confocale ed elettronica, i mitocondri appaiono eterogenei in dimensioni e forma e caretterizzati dalla presenza di creste dilatate ed inclusioni elettrondense. Infine, è stato ottimizzato il processo di purificazione in vitro della proteasi Lon con lo scopo di testare la sua attività proteolitica sulle subunità della catena respiratoria che sono risultate alterate. In conclusione, i dati mostrano che Lon è essenziale per mantenere la funzionalità e la morfologia mitocondriale, la cui alterazione influenza la sopravvivenza delle cellule di cancro al colon.
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Abstract
Cancer cells often develop adaptive mechanisms to survive in a microenvironment where oxygen and nutrients are scarce, and require functional mitochondria to survive. Such stressful microenvironment of proliferating tumours can facilitate reactive oxygen species (ROS) production that represent a source of damage for mitochondrial proteins and DNA. Thus, an efficient turnover of damaged proteins is crucial for preventing this dangerous process.
Lon is a nuclear-encoded, mitochondrial ATP-dependent protease that degrades oxidized damaged proteins, assists protein folding and participates in maintaining mitochondrial DNA levels. Lon is upregulated in some cancer types, and its upregulation appears to be useful for proliferation of cancer cells and their adaptation to a stressful environment (e.g. hypoxia). Conversely, Lon downregulation in cancer cells enhances cell death, probably due to accumulation of protein aggregates in the mitochondria, which in turn affects organelle functionality.
The aim of this study was to characterize mitochondrial alterations in a cell model, namely the RKO colorectal cancer cell line, in which Lon can be conditionally silenced and to set up an in vitro model for evaluating Lon functionality.
Lon mRNA was downregulated by RNA interference using a vector for inducible (doxycycline-regulated) expression of Lon short hairpin RNA; in the presence of doxycycline, we obtained a 71.0±8.5% reduction of Lon expression. Mitochondria of Lon-silenced cells displayed low levels of mtDNA transcripts, reduced levels of several subunits of oxidative phosphorylation complexes (Complex I being the most affected), a marked reduction of oxygen consumption rate, and impaired capability to synthetize ATP. Higher levels of hydrogen peroxide and mitochondrial superoxide anion were also observed. Confocal and electron microscopy evidenced a fragmented mitochondrial network, with mitochondria heterogeneous in size and shape, dilated cristae, vacuoles and electrondense inclusions. Finally, it has been optimized in vitro purification of Lon protease for testing its proteolytic activity on proteins of oxidative phosphorylation complexes whose expression turned out to be altered.
In conclusion, our data show that Lon is essential for correct mitochondrial morphology and functionality, whose impairment alters the survival of colon cancer cells.
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