• COVID-19
• flow cytometry
• polyfunctionality
• T cells
• vaccination

La memoria immunologica è alla base dell'efficacia e della funzionalità del sistema immunitario. Le infezioni naturali e i vaccini inducono la formazione e la successiva espansione di cellule antigene-specifiche (Ag+) che conferiscono una risposta immunitaria potenziata in seguito a riesposizione dello stesso antigene. La vaccinazione contro il SARS-CoV-2 induce una robusta risposta immunitaria specifica, la cui risposta mediata dalle cellule T CD8+ è rilevabile entro una decina di giorni dalla prima vaccinazione. La doppia vaccinazione con i vaccini a RNA porta alla generazione di una risposta Ag+ mediata dai linfociti CD4+ pro-infiammatori, molto ben evidente 6 mesi dopo la vaccinazione.

In questo progetto, grazie all’utilizzo di metodiche avanzate di citometria a flusso e analisi bioinformatiche, abbiamo studiato a fondo la quantità, il fenotipo e la funzionalità della memoria immunitaria specifica per il SARS-CoV-2 in un gruppo di soggetti sani dopo la vaccinazione con una combinazione eterologa di vaccini ChAdOx1-S e BNT162b2, rispetto a un gruppo di soggetti guariti dall'infezione grave da SARS-CoV-2. In particolare, sono stati arruolati 11 donatori vaccinati con una combinazione eterologa (di seguito denominati VAX; 27,0±4,5 anni) e 9 pazienti guariti da COVID-19 (di seguito denominati REC; età media di 35,1±11,1 anni), arruolati durante le visite di follow-up presso le Cliniche di Malattie Infettive dell'Azienda Ospedaliero Universitaria di Modena.

Sono stati raccolti 30 mL di sangue venoso e le cellule mononucleate del sangue periferico (PBMC) sono state isolate e congelate mediante procedure standard. Successivamente, i PBMC sono stati scongelati, lasciati in coltura per 18 ore e quindi stimolati per 16 ore con peptidi di Spike (PepTivator SARS-CoV-2 Prot_S complete, Miltenyi Biotec, Bergisch Gladbach, Germania). Dopo la stimolazione, è stato utilizzato un saggio citofluorimetico che rivela molecole indotte dall'attivazione (AIM) e permette di quantificare la percentuale e il fenotipo delle cellule T Ag+. Sono stati utilizzati i seguenti marcatori: CXCR3, CXCR5, CCR6, CD69, CD137, CD95, CD45RA, CCR7, CD28, PD-1, CD27, CD4, CD8, CD3, CD57, CD45. Le popolazioni T helper (Th) specifiche identificate dal saggio AIM sono definite, all'interno delle cellule CD137+CD69+, come segue: Th1 (CXCR5-CXCR3+CCR6-), Th0Th2 (CXCR5-CXCR3-CCR6-), Th17 (CXCR5-CXCR3-CCR6+), Th follicolari (CXCR5+CXCR3+PD-1+). La marcatura intracellulare delle citochine (ICS) è stata utilizzata per quantificare la percentuale e la polifunzionalità di cellule T Ag+ che producono IL-2, IL-17, TNF, IFN-, CD107a e granzima B (GrzB).

La percentuale di cellule Ag+ CD4+ e CD8+ è paragonabile negli individui REC e VAX. Il gruppo VAX mostra una percentuale maggiore di cellule Ag+ CD8+ Th1 rispetto al gruppo REC. Inoltre, la percentuale di cellule Ag+ di memoria (centrali, effettrici ed EMRA) è maggiore nei VAX, suggerendo che il vaccino stabilisca una memoria immunologica a lungo termine. Abbiamo riscontrato che il gruppo REC ha una percentuale maggiore di T CD4+ polifunzionali rispetto al gruppo VAX. In particolare, la percentuale di cellule T CD4+ che producono IL-2, IL-17 e TNF è maggiore rispetto al gruppo VAX. Percentuali simili di IFN-γ, CD107a e GrzB sono state riscontrate tra i due gruppi. I linfociti T CD8+ hanno proprietà funzionali simili tra i due gruppi.

In conclusione, i dati ottenuti finora suggeriscono che la vaccinazione fornisca uno sviluppo specifico dell'immunità a lungo termine. La caratterizzazione immunologica delle cellule B dei REC e VAX, che ha lo scopo di capire la durata della memoria ed il repertorio dei linfociti che producono anticorpi, è ancora in fase di studio.

Immunological memory is at the basis of the immune system efficacy and functionality. Natural infection and vaccines induce the formation and subsequent expansion of antigen (Ag)-specific cells that provide enhanced responses upon re-exposure to the analogous antigen. SARS-CoV-2 vaccination induces a robust specific immune response. CD8+ T cell response can be detectable within a few days after the first vaccination, and dual vaccination with RNA vaccines leads to strong generation of virus-specific CD4+ T cell response with a TH1 profile that is well evident 6 months after vaccination. Here, by using advances flow cytometry and sophisticated cellular analyses, we deeply investigated the magnitude, phenotype and functionality of SARS-CoV-2–specific immune memory in one group of healthy subjects after heterologous vaccination, compared to a group of subjects who recovered from SARS-CoV-2 infection. Two groups of subjects were enrolled in this study. The first was formed by 9 COVID-19 recovered patients (hereafter called REC; mean age of 35.1 ± 11.1 years), enrolled during follow-up visits at the Infectious Diseases Clinics of the Azienda Ospedaliero Universitaria di Modena. Also, 11 vaccinated donors were enrolled (hereafter called VAX; 27.0 ± 4.5 years) vaccinated with heterologous combination of ChAdOx1-S and BNT162b2 vaccines. Thirty mL of venous blood were collected and centrifuged to isolate plasma and then obtain peripheral blood mononuclear cells (PBMC) that were vitally stored in liquid nitrogen. Then, frozen PBMC were thawed, rested for 18 hours and stimulated with peptides from the Spike protein (PepTivator SARS-CoV-2 Prot_S complete, Miltenyi Biotec, Bergisch Gladbach, Germany). After in vitro stimulation, activation induced marker (AIM) assay was used to quantify the percentage and investigate the phenotype of Ag-specific T cells. The following markers were used: CXCR3, CXCR5, CCR6, CD69, CD137, CD95, CD45RA, CCR7, CD28, PD-1, CD27, CD4, CD8, CD3, CD57, CD45. T helper (Th) populations identified by AIM assay are defined, within CD137+CD69+ cells, as follows: Th1 (CXCR5-CXCR3+CCR6-), Th0/Th2 (CXCR5-CXCR3-CCR6-), Th17 (CXCR5-CXCR3-CCR6+), follicular Th (CXCR5+CXCR3+PD-1+). Intracellular cytokine staining (ICS) was used to quantify the percentage of Ag-specific T cells producing different cytokines such as IL-2, IL-17, TNF, IFN-, CD107a and granzyme B (GrzB). The percentage of Ag-specific CD4+ and CD8+ T cells was comparable in REC and VAX individual. VAX shows higher percentage of Th1 Ag-specific CD8+ T cells compared to REC. Additionally, the percentage of Ag-specific memory cells (either central, effector and EMRA) was increased in VAX suggesting that the vaccine establishes a long-term immunological memory. The function of antigen-specific T cells was evaluated after in vitro stimulation and in particular, their polyfunctionality, i.e. the capability to produce different cytokines simultaneously. We found that the REC group showed higher percentage of polyfunctional CD4+ T cells compared to the VAX group after in vitro stimulation. In particular, the percentage of CD4+ T cells producing IL-2, IL-17 and TNF was higher compared to the VAX. Similar percentages of IFN-γ, CD107a and GrzB were found among the two groups. However, the functional properties of CD8+ T cells was similar between the two groups. In conclusion, the data obtained so far suggest that vaccination provides a specific development of long-term immunity. In order to get a complete characterization of the long-term immune memory in REC and VAX, the analysis of the B cell repertoire is still under investigation.