Riassunto analitico
Il termine epidermolisi bollosa fa riferimento ad un gruppo di malattie bollose caratterizzate da fragilità della pelle con gravità variabile, causata da mutazioni che colpiscono varie proteine strutturali della pelle. Sono presenti 4 tipi principali di EB, generalmente prendono il nome di: Epidermolisi Bollosa Semplice (EBS), Epidermolisi Bollosa Giunzionale (EBG), Epidermolisi Bollosa Distrofica (EBD) e Sindrome di Kindler. Ogni sottotipo di epidermolisi bollosa ereditaria viene suddiviso in base alla modalità di trasmissione e alla combinazione di vari fattori fenotipici, ultrastrutturali, immunoistochimici e molecolari. L'EBS comprende tutti i sottotipi di EB che presentano fragilità meccanica e vesciche confinate all'epidermide, e generalmente viene divisa in due gruppi: basale e sopra-basale, questo in base al sito in cui avviene la rottura della struttura all'interno dell'epidermide. La EBG include tutti i sottotipi di EB in cui le vesciche si sviluppano all'interno delle giunzioni tra i vari strati della pelle, in particolare la struttura coinvolta è chiamata giunzione dermo-epidermica. La forma distrofica, invece, include i sottotipi di EB in cui le vesciche si generano all'interno del derma soprastante. La Sindrome di Kindler è stata inserita nella classificazione di EB solo nel 2008, descrive una forma caratterizzata dalla presenza di un fenotipo clinico unico tra le varie forme di epidermolisi bollosa, in cui troviamo fotosensibilità, e vesciche che si formano a diversi livelli, all'interno o sotto la giunzione dermo-epidermica.
L'epidermolisi bollosa è a trasmissione sia autosomico dominante sia autosomico recessivo, ma non sono assenti mosaicismi o eterozigosi composta. I tipi principali di EBS sono causati da mutazioni in geni codificanti proteine chiamate cheratine, in particolare cheratina 5 e la cheratina 14. Nella EBG invece, i geni mutati sono generalmente LAMA3, LAMB3, LAMC2, codificanti le diverse catene della proteina laminina 322 (laminina 5), COL17A1 che codifica il collagene di tipo XVII, e ITGB4 e ITGA6 che codificano le catene beta-4 e alfa-6 delle integrine. La forma distrofica invece (sia dominane che recessiva), è causata da mutazioni nel gene COL7A1, codificante il collagene di tipo VII. Infine, il gene mutato nella Sindrome di Kindler si chiama KIND1 e codifica una proteina membro della fermitin family homolog 1 (FFH1) chiamato kindlin-1.
Ad oggi, i test genetici per l'epidermolisi bollosa rappresentano la fase finale di un lavoro clinico lungo, intenso e dispendioso, il quale include la raccolta dei dettagli personali dei pazienti, della storia famigliare e classificazione del sottotipo tramite microscopia elettronica o immunofluorescenza effettuate su biopsia cutanea. I limiti della diagnosi genetica convenzionale di epidermolisi bollosa possono essere superati dai progressi ottenuti tramite le tecniche di next generation sequencing (NGS), che permettono di analizzare un pannello di geni e non un singolo gene per volta, e questo permette di migliorare il tempo di diagnosi, i costi e l'accuratezza nell'identificare il difetto che causa il fenotipo nel paziente con EB. Lo scopo del mio lavoro è stato quello di sviluppare un custom panel (Ampliseq) che permetta un completo e accurato sequenziamento di tutti i geni conosciuti fin'ora, che entrano nell'eziopatogenesi dell'epidermolisi bollosa. Per testare il pannello viene seguito un protocollo che prevede inizialmente una procedura semi-automatica di preparazione delle librerie dei pazienti seguito poi da una corsa di sequenziamento con la piattaforma Ion Torrent Personal Genome Machine, il tutto su una coorte ristretta di 9 pazienti (tutti con con diagnosi molecolare e genetica accertata di EB), questo per ottenere dati riguardo alla sensibilità, specificità e accuratezza di questa tipologia di procedura di next generation sequencing, e successivamente confrontarli con quelli ottenuti tramite il metodo di squenziamento di Sanger.
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Abstract
The term Epidermolysis bullosa (EB) refers to a group of mechanobullous genodermatoses, characterized by varying degrees of skin fragility due to mutations in various skin structural proteins. This category of skin disorders comprises four major EB types, usually called: Epidermolysis Bullosa Simplex (EBS), Junctional Epidermolysis Bullosa (JEB), Dystrophic Epidermolysis Bullosa (DEB), and Kindler Syndrome (KS). Each of the many subtypes of inherited Epidermolysis Bullosa is currently defined by its mode of transmission and a combination of phenotypes, ultrastructural, immunohistochemical, and molecular findings. EBS encompasses all subtypes of EB having mechanical fragility and blistering confined to the epidermis, and generally is separated into suprabasal and basal groups, based on the histopathological site of cleavage within the epidermis. The JEB form includes all subtypes of EB in which blisters develop within the mid portion of the junction, a structure called basement membrane zone (also known as dermal-epidermal junction, DEJ). DEB, instead, includes all EB subtypes in which blistering occurs within the uppermost dermis (just beneath the lamina densa of the basement membrane zone). The Kindler Syndrome, added to the EB classification only in 2008, describes a specific entity characterized by the presence of clinical phenotypes features unique among EB, such as, mainly, photosensitivity, and blistering that arise in multiple levels within and/or beneath the BMZ, rather than within a discrete plane, as occurs in all the other EB types.
EB can be transmitted in an autosomal dominant or autosomal recessive model, and are not absent mosaicism or compound heterozygosity. The major EBS types are caused by mutations in genes encoding keratin proteins (which are the typical intermediate filament proteins of epithelia) and, specifically, mutations involved keratin 5 and keratin 14. In JEB forms mutated genes are mainly LAMA3, LAMB3, LAMC2 encoding the different chains of the laminin 332 protein (previously called laminin 5), COL17A1 which encode the type XVII collagen, and ITGB4 and ITGA6 which encodes the alpha-6 and beta-4 chains of the integrin protein. The dystrophic types (both dominant and recessive), instead, are caused by mutations in COL7A1 gene, encoding the type VII collagen. Finally, the mutated gene that causes the Kindler Syndrome is KIND1 encoding a member of the fermitin family homolog 1 (FFH1) called Kindlin-1 which is a focal adhesion adaptor protein linking filamentous actin in the cell cortex to membrane protein.
So far, genetic testing of EB represented the final phase of an intensive, expensive and time consuming clinical pathway, which includes the gathering of detailed personal and family history and subtype classification by transmission electron microscopy (EM) and immunofluorescence mapping (IFM) performed on skin biopsy. The intrinsic limitations of conventional genetic diagnosis in the EB, can be overcome by the progresses achieved by technologies of Next Generation Sequencing (NGS), that through the sequencing in parallel of a panel of genes instead of single candidate genes allow to improve diagnosis timing, costs and accuracy identify the genetic factors that influence the clinical expression of patients with EB. The effort of my work was to develop a customized cost-effective amplicons panel (AmpliSeq) for a complete and accurate sequencing of all the pathogenic genes already known in EB. The NGS panel was therefore handled with a semi-automatized procedure for library preparation and sequencing by the Ion Torrent Personal Genome Machine (PGM) platform on a small cohort of nine patients (with molecular and genetic diagnosis ascertained), to obtain a proof of concept of the sensitivity, specificity, and accuracy of this kind of NGS procedure and then compared to the results obtained by Sanger sequencing.
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