Riassunto analitico
La nanomedicina si pone come obiettivo la realizzazione di sistemi di drug delivery per la veicolazione di farmaci (idrofobi e idrofili) allo scopo di migliorarne la biodistribuzione e la farmacocinetica riducendo al minimo la tossicità. Le Solid Lipid Nanoparticles (SLNs), sistemi colloidali di dimensioni comprese tra i 50-1000 nm, sono formulate con lipidi GRAS (Sostanze Ritenute Generalmente Sicure) e si presentano come sistemi solidi a temperatura ambiente. Le SLNs sono considerate biocompatibili, biodegradabili ed utili nella veicolazione di farmaci con bassa biodisponibilità orale. Infatti, grazie alla loro spiccata lipofilia ed al rivestimento esterno idrofilico con tensioattivo seguono il percorso di internalizzazione intestinale dei chilomicroni e quindi un assorbimento sistemico diretto attraverso la circolazione linfatica. Il sistema linfatico, per la frequenza con cui le metastasi raggiungono il tessuto linfoide ed in particolare i linfonodi, è considerato un interessante target per farmaci con azione antitumorale e per gli agenti diagnostici (MRI). Attualmente vengono sviluppati sistemi teranostici tra i quali nanoparticelle magnetiche di ossido di ferro le quali possano diagnosticare la sede del tumore o della metastasi e, in seguito all’applicazione di un campo magnetico esterno, possono surriscaldarsi ed uccidere le cellule tumorali (Magnetic hyperthermia). Molto spesso tali nanoparticelle magnetiche necessitano di un coating esterno in modo da prevenirne l’aggregazione e renderle più stabili nei fluidi biologici.
Questo progetto di tesi ha come scopo la progettazione e la formulazione di nanocarriers solidi lipidici per la veicolazione di nanoparticelle di ossido di ferro, rivestite con eparina (Fe@hepa), verso il sistema linfatico attraverso l’assorbimento intestinale. Nella prima parte del lavoro sono state realizzate diverse formulazioni allo scopo di trovare le condizioni preparative ottimali. Le condizioni ottimali si sono ottenute mediante l’utilizzo di un mono-digliceride bassofondente (Geleol ™) e un tensioattivo a base lipidica con alto HLB( Gelucire 50/13®), esterificato con catene di PEG, in modo da impedire il sequestro di tali nanoparticelle da parte del RES. Con questi due componenti è stato possibile formulare un’emulsione multipla (A/O/A) nella cui fase acquosa interna si trovavano disperse le nanoparticelle di Fe@hepa. Succesivamente è stata effettuata la caratterizzazione tecnologica dei sistemi in termini di dimensioni e di carica superficale mediante photon correlation spectroscopy (PCS) e morfologica tramite microscopia elettronica a scansione (SEM) ed a trasmissione (TEM). Al fine di valutare l’efficienza di incapsulazione e la stabilità dell’incapsulazione, è stata messa a punto una metodica di quantificazione del Fe@hepa tramite analisi spettrofotometrica. Successivamente sono stati effettuati dei test di citotossicità preliminari su cellule di adenocarcinoma colon-rettale (CaCo-2) mediante saggi MTT testando i nanocarriers (caricati con nanoparticelle di Fe@hepa o scarichi) e Fe@hepa libero in diverse concentrazioni e a diversi tempi di incubazione, seguiti da saggi di internalizzazione in cui è stata determinata la quantità di Fe@hepa direttamente all’interno delle cellule.
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Abstract
Nanomedicine aims to develop drug delivery system able to deliver hydrophilic/lipophilic drugs improving their biodistribution, pharmacokinetics and decreasing their toxicity. Solid Lipid Nanoparticles (SLNs), mainly composed of GRAS lipid (Generally Recognized As Safe) are colloidal systems solid at room temperature with a mean diameter ranging from 50 to 1000 nm. SLNs present many advantages like biocompatibility, biodegradability and also the possibility to embed drugs with poor oral bioavailability. In fact, due to their suitable hydrophobic/hydrophilic balance and their surface charge these systems can be internalized, in the same way than chylomicrons, directly by the lymphatic circulation through intestinal absorption. Nowadays lymphatic system is considered an interesting target for anti-cancer drugs and contrast agents (MRI) because it plays an active role in spreading solid tumor disseminating metastatic cancer cells throughout the body. Recently magnetic nanoparticles (MNPs) are widely studied since they represent a particularly appropriate theranostic tool due to their ability to be simultaneously functionalized and guided by external magnetic fields. In fact, MNPs guided by an external magnetic field can be used for both diagnostic and therapeutic aims being able to promote diagnosis and in the same time elimination of cancer cells by the magnetic hyperthermia phenomena. Frequently this kind of nanoparticles, due to their magnetic properties, need an external coating to prevent aggregation and increase stability in biological fluids.
In this project a solid lipid nanocarriers (SLN) has been formulated to delivery via intestinal lymphatic absorption magnetic iron oxide nanoparticles coated by heparin (Fe@hepa), being the heparin coating not stable in physiological environments. Firstly, different lipid based systems were formulated to obtain a nanocarriers with appropriate characteristics. Optimized condition was reached by using a monoglycerides lipid with a low melting point (Geleol ™) and a lipid based surfactant with a high HLB value (Gelucire 50/13®) linked with PEG chain, producing carriers able to avoid opsonisation and RES uptake. A multiple emulsion (W/O/W) method was employed for the SLN formulation dispersing Fe@hepa in the internal aqueous phase. Technological characterization was performed using photon correlation spectroscopy (PCS), to get information about size and surface charge, while morphological features were evaluated through scanning electron microscopy (SEM) and transmission electron microscopy (TEM). In order to evaluate encapsulation efficiency and the stability of the Fe@hepa encapsulation in SLN, a colorimetric method for the Fe@hepa quantification was developed. Finally, preliminary in vitro studies on colon adenocarcinoma cells (CaCo-2) were performed: the cytotoxicity of naked Fe@hepa, Fe@hepa-loaded SLN and unloaded SLN was evaluated by MTT tests and internalization extent was studied by the direct quantification of Fe@hepa inside the cell lysate.
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