Riassunto analitico
I nano-anticorpi (VHH) sono frammenti di anticorpi a sola catena pesante originati nei camelidi e hanno la funzione di legare l’antigene. In questo studio, due gruppi di VHH sono stati selezionati e caratterizzati funzionalmente come modulatori allosterici di recettori dell’ormone follicolo stimolante (FSH; FSHR) e dell’ormone luteinizzante (LH; LHCGR), con lo scopo di controllare le funzioni riproduttive.
I VHH anti-FSHR sono stati selezionati con phage display e sottoposti a sequenziamento di seconda generazione, mentre i VHH anti-LHCGR sono stati caratterizzati mediante tre differenti saggi funzionali. In cellule umane HEK293 over-esprimenti LHCGR, e trattate con LH e specifici VHH, la produzione di adenosina monofosfato ciclico (cAMP) è stata valutata mediante bioluminescence resonance energy transfer (BRET), mentre l’attività di cAMP-responsive element (CRE) è stata valutata con un sistema reporter plasmidico. La produzione di cAMP è stata valutata anche in cellule di Leydig tumorali di topo, esprimenti naturalmente il recettore muruino, mediante homogeneous time-resolved fluorescence (HTRF).
Alcuni VHH anti-LHCGR hanno modulato allostericamente l’attivazione delle vie di trasduzione del segnale mediate dal recettore in risposta a LH. In particolare, alcuni VHH hanno agito da modulatori allosterici positivi (PAM), altri come modulatori allosterici negativi (NAM).
Saranno necessarie ulteriori analisi per confermare e approfondire le conoscenze degli effetti di questi nano-anticorpi. In futuro, VHH ottimizzati potrebbero essere utilizzati per modulare l’azione delle gonadotropine nell’ambito delle tecniche di fecondazione assistita, nello sviluppo di anticoncezionali non-ormonali, nel trattamento della sindrome dell’ovaio policistico (PCOS) o di tumori ovarici associati a overespressione di FSHR.
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Abstract
Nanobodies (VHHs) are heavy chain-only antibody fragments derived from camelids and have the function of antigen binding. In this study, two groups of VHHs were selected and functionally characterized as allosteric modulators of follicle stimulating hormone receptor (FSH; FSHR) and luteinizing hormone receptor (LH; LHCGR), with the objective of controlling reproductive functions.
Anti-FSHR VHHs were selected via phage display and subjected to second-generation sequencing, whereas anti-LHCGR VHHs were characterized by three different functional assays. In human HEK293 cells over-expressing LHCGR treated with LH and specific VHHs, cyclic adenosine monophosphate (cAMP) production was assessed by bioluminescence resonance energy transfer (BRET), while cAMP-responsive element (CRE) activity was assessed with a plasmid reporter system. The production of cAMP was also assessed in mouse tumor Leydig cells, naturally expressing the murine receptor, by homogeneous time-resolved fluorescence (HTRF).
Some anti-LHCGR VHHs allosterically modulated the activation of receptor-mediated signal transduction pathways in response to LH. In particular, some VHH acted as positive allosteric modulators (PAM), others as negative allosteric modulators (NAM).
Further analyses will be necessary to confirm and deepen our understanding of the effects of these nanobodies. In the future, optimized VHHs could be employed to modulate the action of gonadotropins in assisted reproduction techniques, in the development of non-hormonal contraceptives, in the treatment of polycystic ovary syndrome (PCOS) or in the treatment of ovarian tumors associated with FSHR overexpression.
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