Riassunto analitico
In tempi recenti, si stanno sviluppando nanoanticorpi (Nbs) che, agendo da modulatori allosterici dei recettori delle gonadotropine, potrebbero essere utilizzati a scopo contraccettivo. il principio d'azione prevederebbe il blocco dell’ovulazione e/o della follicologenesi, senza alterare la steroidogenesi.
In questo progetto di tesi sono stati testati due Nbs in grado di modulare allostericamente il recettore (LHCGR) dell’ormone luteinizzante (LH) e della gonadotropina corionica umana (hCG). In particolare, è stata valutata la loro capacità di influire positivamente (PAM), negativamente (NAM) o in maniera “biased” (BAM) sull’attivazione della via di trasduzione del segnale dell’andenosina monofosfato ciclico (cAMP)/proteina chinasi A (PKA), la quale media la sintesi di ormoni steroidei gonadici.
Gli esperimenti in vitro sono stati svolti in cellule primarie della granulosa umane (hGLC), le quali sono state trattate con dosi crescenti di LH, nonchè di due nanoanticorpi denominati “D11” ed “E5”. Al termine dei trattamenti, sono stati misurati l’accumulo intracellulare di cAMP, la produzione di progesterone e di estradiolo utilizzando la metodica Homogenous Time-Resolved Fluorescence (HTRF), e la fosforilazione delle proteine extracellularly regulated kinase 1/2 (ERK1/2) e cAMP response element-binding protein (CREB) con Western blotting. La vitalità cellulare è stata testata mediante saggio MTT. Cellule trattate con nanoanticorpo privo di bersaglio (anti-HEL) sono state utilizzate come controllo.
I risultati ottenuti indicano che il trattamento con Nbs D11 non modifica l’accumulo intracellulare di cAMP indotto da LH, il cui effetto è simile a quello ottenuto con anti-HEL.
Il trattamento cellulare con Nbs E5 potenzia l’effetto delle concentrazioni 3 nM e 10 nM di LH. In particolare, l’aumento di accumulo intracellulare di cAMP avviene quando le cellule vengono trattate alla concentrazione 10 nM,30 nM e 100nM di nanoanticorpo. Pertanto, E5 si comporta come PAM. Questi risultati sono stati confermati con Western blotting, da cui si evince un aumento della fosforilazione della proteina ERK1/2, in cellule trattate con E5, mentre D11 non ha prodotto alcun effetto.
Il trattamento con entrambi i nanoanticorpi non riduce la vitalità cellulare.
Questo studio ha dimostrato che uno dei due nanoanticorpi analizzati ha un’azione PAM su LHCGR. In particolare, E5 potenzia la produzione intracellulare di cAMP, suggerendo che possa essere testato in vivo per il suo potenziale di supporto dell’azione di LH.
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