Riassunto analitico
Attualmente sono in fase di sviluppo nanoanticorpi (Nbs) che agiscono da modulatori allosterici del recettore (FSHR) dell’ormone follicolo stimolante (FSH), con lo scopo di ottenere molecole in grado di dare un effetto contraccettivo non-ormonale. FSHR è un recettore accoppiato a proteina G ed è espresso sia nelle cellule del Sertoli, sia nelle cellule della granulosa ovariche, dove è coinvolto nella regolazione della crescita e maturazione del follicolo.
Nel seguente studio sono stati testati due Nbs, con l’obiettivo di modulare i segnali mediati da FSH. I modulatori allosterici sono definiti come positivi (PAM), negativi (NAM) o biased (BAM), a seconda di come impattano sull’attivazione del cell signalling. In questo caso, ho studiato l’attivazione della cyclic adenosine monophosphate (cAMP)/protein kinase A (PKA)-pathway. In cellule primarie della granulosa umana (hGLC) è stato valutato l’accumulo intracellulare di cAMP e la produzione di progesterone mediante homogeneous time-resolved flourescence (HTRF), e la fosforilazione delle proteine extracellularly regulated kinase 1/2 (ERK1/2) e cAMP response element-binding protein (CREB) mediante Western blotting. Le cellule sono state trattatte con dosi crescenti di FSH, in presenza e assenza dei nanoanticorpi denominati NbsA e NbsB. Infine, è stata valutata la funzionalità mitocondriale mediante saggio MTT, quale indicatore di vitalità cellulare.
I risultati ottenuti mostrano che l’NbsA non determina variazioni nell’accumulo intracellulare di cAMP, indotti dalla stimolazione all’FSH. L’NbsA agisce come NAM sulla produzione di P4, ad eccezione della concentrazione 10 nM in cui si registra un incremento delle concentrazioni di P4. Al contrario, l’NbsB determina una riduzione del cAMP rispetto al controllo negativo, mentre sul P4 sembra non sortire particolare effetto rispetto al campione di controllo non stimolato. Entrambi i nanoanticorpi non influiscono sulla vitalità cellulare e sul processo di morte apoptotica.
La valutazione della fosforilazione delle proteine ERK1/2 e CREB ha confermato quanto visto con il cAMP, dimostrando che per il NbsA non si registra una variazione della fosforilazione delle proteine in esame, mentre per NbsB si dimostra che la presenza del nanoanticorpo riduce la fosforilazione e quindi l’attivazione della proteina ERK1/2 e CREB, nonostante poi a valle non riduca la produzione di P4.
In conclusione, i due nanoanticorpi sono differentemente in grado di modulare allostericamente la funzionalità di FSHR. Nel caso di NbsA non sembra avere particolari effetti sulla produzione di cAMP, mentre NbsB agisce complessivamente come modulatore allosterico biased sul signalling attivato dall’interazione tra FSHR e il suo ligando FSH, suggerendo la possibilità di testarlo in vivo. NbsB è risultato in grado di inibire l’accumulo intracellulare di cAMP; sulla via steroidogenica, in particolar modo sulla produzione di P4, non risulta avere particolare effetto.
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